• ფეისბუქი
  • linkedin
  • youtube

PCR რეაგენტების ადრეულ ეტაპზე პრაიმერებისა და ზონდების მუშაობის შემოწმება და ყველაზე შესაფერისი რეაქციის პირობების განსაზღვრა არის წინაპირობა, რათა უზრუნველყოს ფორმალური ექსპერიმენტების გლუვი პროგრესი.

მაშ, როგორ უნდა დავადასტუროთ პრაიმერის ზონდი ადრეულ ეტაპზე?

ძირითადი ინდიკატორებია საბაზისო, გაძლიერების მრუდი, ct მნიშვნელობა, გაძლიერების ეფექტურობა, დაბალი კონცენტრაციის ნიმუშის გამოვლენა, CV და ა.შ.

საბაზისო

საბაზისო არის ჰორიზონტალური ხაზი PCR გაძლიერების მრუდში.PCR გამაძლიერებელი რეაქციის პირველ რამდენიმე ციკლში, ფლუორესცენციის სიგნალი დიდად არ იცვლება და ქმნის სწორ ხაზს.ეს სწორი ხაზი არის საბაზისო ხაზი.

PCR პრაიმერის ზონდების სკრინინგისას ყურადღება მიაქციეთ არის თუ არა საბაზისო დონე.პრაიმერის ზონდის კონცენტრაციის სისუფთავე გავლენას მოახდენს საბაზისო ხაზზე, როგორიცაა საბაზისო ხაზის აწევა ან დაცემა.საბაზისო ასევე ძალიან ინტუიციური მაჩვენებელია.
ანალიზი

გაძლიერების მრუდი

კიდევ ერთი ინტუიციური მაჩვენებელია გაძლიერების მრუდის ფორმა.უმჯობესია გქონდეთ S- ფორმის მრუდი, რათა თავიდან აიცილოთ მეორადი გაძლიერება ან სხვა არანორმალური ამპლიფიკაციის მრუდები.
null

Ct მნიშვნელობა

ციკლების რაოდენობა, რომელიც შეესაბამება შებრუნების წერტილს საწყისი ხაზიდან ექსპონენციალურ ზრდამდე არის Ct მნიშვნელობა.

ერთი და იგივე ნიმუშისთვის, სხვადასხვა პრაიმერის ზონდი იწვევს სხვადასხვა გაძლიერების მრუდს და შესაბამის Ct მნიშვნელობაზე გავლენას მოახდენს გაძლიერების ეფექტურობა და ჩარევის ხარისხი.თეორიულად, რაც უფრო მცირეა პრაიმერის ზონდის Ct მნიშვნელობა, მით უკეთესი.

ანალიზი-3

გაძლიერების ეფექტურობა

PCR გაძლიერების ეფექტურობის შეფასების ერთ-ერთი ყველაზე საიმედო და სტაბილური მეთოდია სტანდარტული მრუდი, რომელიც ასევე ფართოდ არის აღიარებული მკვლევარების მიერ.მეთოდი მოიცავს ნიმუშების სერიის დამზადებას სამიზნე შაბლონების შედარებითი რაოდენობის გასაკონტროლებლად.ეს ნიმუშები, როგორც წესი, მზადდება კონცენტრირებული მარაგის ხსნარების სერიული განზავებით, ყველაზე ხშირად გამოყენებული არის 10-ჯერადი განზავება.განზავებული ნიმუშების სერიის გამოყენებით, სტანდარტული qPCR პროგრამის გამოყენებით გასაძლიერებლად Cq მნიშვნელობის მისაღებად და ბოლოს დახაზეთ სტანდარტული მრუდი თითოეული ნიმუშის კონცენტრაციისა და შესაბამისი Cq მნიშვნელობის მიხედვით, რათა მივიღოთ წრფივი განტოლება Cq= -klgX0+b და გაძლიერების ეფექტურობა E=10(-1 /k)-1.რაოდენობრივი ანალიზისთვის qPCR გამოყენებისას, ამპლიფიკაციის ეფექტურობა უნდა იყოს 90%-110% (3.6>k>3.1) ფარგლებში.

ანალიზი-4

დაბალი კონცენტრაციის ნიმუშების გამოვლენა

როდესაც ნიმუშის კონცენტრაცია დაბალია, სხვადასხვა პრაიმერის ზონდების გამოვლენის სიჩქარე განსხვავებულია.ჩვენ ვირჩევთ 20 დაბალი კონცენტრაციის ნიმუშს გასამრავლებლად და საუკეთესოა პრაიმერ-ზონდის სისტემა, რომელსაც აქვს ყველაზე მაღალი გამოვლენის სიჩქარე.

ანალიზი-5

ვარიაციის კოეფიციენტი (CV)

10 დუბლიკატი ნიმუშის გამოვლენა შესაძლებელია სხვადასხვა პრაიმერის ზონდებით რეაგენტის ხაზის სტანდარტის მიხედვით ნუკლეინის მჟავას ამპლიფიკაციის გამოვლენისთვის.

ანალიზი-6

რაოდენობრივი რეაგენტები:
სიზუსტე
სიზუსტე ერთ პარტიაში უნდა აკმაყოფილებდეს: ტესტის კონცენტრაციის ლოგარითმული მნიშვნელობის ცვალებადობის კოეფიციენტი (CV,%) არის ≤5%.როდესაც ნიმუშის კონცენტრაცია დაბალია, გამოვლენის კონცენტრაციის ლოგარითმის ცვალებადობის კოეფიციენტი (CV,%) არის ≤10%


ხარისხობრივი რეაგენტები:
სიზუსტე
სიზუსტე ერთი პარტიაში უნდა აკმაყოფილებდეს:

(1) Ct მნიშვნელობის ვარიაციის კოეფიციენტი (CV,%) ≤5%

ერთი და იგივე ნიმუში პარალელურად შემოწმდება 10-ჯერ და ტესტის შედეგები უნდა იყოს თანმიმდევრული


გამოქვეყნების დრო: სექ-18-2021