• ფეისბუქი
  • linkedin
  • youtube

 ფლუორესცენციის რაოდენობრივი PCR (ასევე ცნობილი როგორც TaqMan PCR, შემდგომში FQ-PCR) არის ახალი ნუკლეინის მჟავის რაოდენობრივი ტექნოლოგია, რომელიც შემუშავებულია PE (Perkin Elmer) მიერ შეერთებულ შტატებში 1995 წელს. ეს ტექნოლოგია ეფუძნება ჩვეულებრივ PCR-ს, ფლუორესცენტური ეტიკეტირებული ზონდების დამატებით.მოქნილ PCR-თან შედარებით, FQ-PCR-ს ბევრი უპირატესობა აქვს თავისი რაოდენობრივი ფუნქციის შესასრულებლად.ეს სტატია აპირებს მოკლედ აღწეროს ტექნოლოგიის მახასიათებლები, პრინციპები, მეთოდები და გამოყენება.

1 მახასიათებლები

FQ-PCR არა მხოლოდ აქვს ჩვეულებრივი PCR-ის მაღალი მგრძნობელობა, არამედ ფლუორესცენტური ზონდების გამოყენების გამო, მას შეუძლია პირდაპირ აღმოაჩინოს ფლუორესცენტური სიგნალის ცვლილება PCR გაძლიერების დროს ფოტოელექტრული გამტარობის სისტემის მეშვეობით რაოდენობრივი შედეგების მისაღებად, რაც გადალახავს ჩვეულებრივი PCR-ის ბევრ ნაკლოვანებას.

მაგალითად, ზოგადი PCR პროდუქტების დაკვირვება საჭიროა აგაროზის გელის ელექტროფორეზით და ეთიდიუმის ბრომიდის შეღებვით ულტრაიისფერი შუქით ან პოლიაკრილამიდის გელის ელექტროფორეზით და ვერცხლის შეღებვით.ამას არა მხოლოდ რამდენიმე ინსტრუმენტი სჭირდება, არამედ დრო და ძალისხმევაც.ეთიდიუმის ბრომიდის გამოყენებული ლაქები საზიანოა ადამიანის ორგანიზმისთვის და ეს რთული ექსპერიმენტული პროცედურები იძლევა დაბინძურებისა და ცრუ დადებითი შედეგების შესაძლებლობას.თუმცა, FQ-PCR-ს მხოლოდ ერთხელ სჭირდება სახურავის გახსნა ნიმუშის ჩატვირთვისას, ხოლო შემდგომი პროცესი არის მთლიანად დახურული მილის ოპერაცია, რომელიც არ საჭიროებს PCR შემდგომ დამუშავებას, რაც თავიდან აიცილებს ბევრ ნაკლოვანებას ჩვეულებრივი PCR ოპერაციების დროს.ექსპერიმენტში ძირითადად გამოიყენება PE კომპანიის მიერ შემუშავებული ABI7100 PCR თერმოციკლერი.

ინსტრუმენტს აქვს შემდეგი მახასიათებლები: ① ფართო გამოყენება: მისი გამოყენება შესაძლებელია დნმ-ისა და რნმ-ის PCR პროდუქტის რაოდენობრივი განსაზღვრისთვის, გენის ექსპრესიის კვლევისთვის, პათოგენის გამოვლენისთვის და PCR პირობების ოპტიმიზაციისთვის.② უნიკალური რაოდენობრივი პრინციპი: ფლუორესცენტურად ეტიკეტირებული ზონდების გამოყენებით, ფლუორესცენციის რაოდენობა დაგროვდება PCR ციკლთან ერთად ლაზერული აგზნების შემდეგ, რათა მიაღწიოს რაოდენობრივ დანიშნულებას.③ მუშაობის მაღალი ეფექტურობა: ჩაშენებული 9600 PCR თერმოციკლერი, კომპიუტერის კონტროლირებადი 1-დან 2 საათამდე, რათა დასრულდეს 96 ნიმუშის გაძლიერება და რაოდენობრივი განსაზღვრა ავტომატურად და სინქრონულად.④ არ არის საჭირო გელის ელექტროფორეზი: არ არის საჭირო ნიმუშის განზავება და ელექტროფორეზი, უბრალოდ გამოიყენეთ სპეციალური ზონდი უშუალოდ რეაქციის მილში გამოსავლენად.⑤ არ არის დაბინძურება მილსადენში: მიღებულია უნიკალური სრულად დახურული რეაქციის მილი და ფოტოელექტრული გამტარობის სისტემა, ასე რომ არ არის საჭირო დაბინძურებაზე ფიქრი.⑥ შედეგები რეპროდუცირებადია: რაოდენობრივი დინამიური დიაპაზონი არის ხუთ ბრძანებამდე.აქედან გამომდინარე, მას შემდეგ, რაც ეს ტექნოლოგია წარმატებით განვითარდა, იგი აფასებდა ბევრ მეცნიერ მკვლევარს და გამოიყენებოდა მრავალ სფეროში.

2 პრინციპები და მეთოდები

FQ-PCR-ის მუშაობის პრინციპია Taq ფერმენტის 5'→3' ეგზონუკლეაზური აქტივობის გამოყენება PCR რეაქციის სისტემაში ფლუორესცენტურად მარკირებული ზონდის დასამატებლად.ზონდს შეუძლია სპეციალურად ჰიბრიდიზაცია მოახდინოს დნმ-ის შაბლონთან, რომელიც შეიცავს პრაიმერის თანმიმდევრობას.ზონდის მე-5"ბოლო ეტიკეტირებულია ფლუორესცენციის ემისიის გენით FAM (6-კარბოქსიფლუორესცეინი, ფლუორესცენციის ემისიის პიკი 518ნმ-ზე), ხოლო მე-3"ბოლო ეტიკეტირებულია ფლუორესცენციის ჩაქრობის ჯგუფით TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine, 6-carboxyetramethylrhodamine,58). ზონდის ფოსფორილირება ხდება PCR გაძლიერების დროს ზონდის გაშლის თავიდან ასაცილებლად.როდესაც ზონდი ხელუხლებელი რჩება, ჩამქრალი ჯგუფი თრგუნავს ემიტირებული ჯგუფის ფლუორესცენციულ ემისიას.მას შემდეგ, რაც ემიტირებული ჯგუფი გამოეყოფა ჩაქრობის ჯგუფს, დათრგუნვა იხსნება და ოპტიკური სიმკვრივე 518 ნმ-ზე იზრდება და გამოვლინდება ფლუორესცენციის გამოვლენის სისტემით. რენატურაციის ფაზაში, ზონდი ჰიბრიდირებულია შაბლონის დნმ-თან და Taq ფერმენტი შაბლონის დნმ-ის გაფართოების ფაზაში მოძრაობს გაფართოების გასწვრივ.ზონდის გათიშვისას იხსნება ჩაქრობის ეფექტი და გამოიყოფა ფლუორესცენტური სიგნალი.შაბლონის კოპირების ყოველ ჯერზე, ზონდი წყდება, რასაც თან ახლავს ფლუორესცენტური სიგნალის გათავისუფლება.ვინაიდან არსებობს ერთი-ერთზე კავშირი გამოთავისუფლებული ფტორფორების რაოდენობასა და PCR პროდუქტების რაოდენობას შორის, ეს ტექნიკა შეიძლება გამოყენებულ იქნას შაბლონის ზუსტი რაოდენობრივი დასადგენად.ექსპერიმენტული ინსტრუმენტი ძირითადად იყენებს PE კომპანიის მიერ შემუშავებულ ABI7100 PCR თერმოციკლერს და ასევე შეიძლება გამოყენებულ იქნას სხვა თერმოციკლერები.თუ ექსპერიმენტისთვის გამოიყენება ABI7700 რეაქციის ტიპის რეაქციის სისტემა, რეაქციის დასრულების შემდეგ რაოდენობრივი შედეგები შეიძლება პირდაპირ იყოს კომპიუტერული ანალიზის საშუალებით.თუ იყენებთ სხვა თერმოციკლერებს, საჭიროა გამოიყენოთ ფლუორესცენტული დეტექტორი, რათა გაზომოთ ფლუორესცენციის სიგნალი რეაქციის მილში, რათა გამოვთვალოთ RQ+, RQ-, △RQ.RQ+ წარმოადგენს ნიმუშის მილის ფლუორესცენტური ემისიის ჯგუფის ლუმინესცენციის ინტენსივობის თანაფარდობას ჩაქრობის ჯგუფის ლუმინესცენციის ინტენსივობასთან, RQ- წარმოადგენს ცარიელ მილში ორის თანაფარდობას. მიღება შეიძლება.ფლუორესცენტური ზონდების დანერგვის გამო, ექსპერიმენტის სპეციფიკა მნიშვნელოვნად გაუმჯობესებულია.ზონდის დიზაინი ზოგადად უნდა აკმაყოფილებდეს შემდეგ პირობებს: ① ზონდის სიგრძე უნდა იყოს დაახლოებით 20-40 ფუძე, რათა უზრუნველყოფილი იყოს შებოჭვის სპეციფიკა.②GC ფუძეების შემცველობა არის 40%-დან 60%-მდე, რათა თავიდან იქნას აცილებული ერთი ნუკლეოტიდური თანმიმდევრობების დუბლირება.③ მოერიდეთ ჰიბრიდიზაციას ან პრაიმერებთან გადახურვას.④ ზონდსა და შაბლონს შორის შეკავშირების სტაბილურობა უფრო მაღალია, ვიდრე პრაიმერისა და შაბლონის შეკავშირების სტაბილურობა, ამიტომ ზონდის Tm მნიშვნელობა უნდა იყოს მინიმუმ 5°C-ით მაღალი, ვიდრე პრაიმერის Tm მნიშვნელობა.გარდა ამისა, ზონდის კონცენტრაცია, ჰომოლოგია ზონდსა და შაბლონის თანმიმდევრობას შორის და მანძილი ზონდსა და პრაიმერს შორის ყველა გავლენას ახდენს ექსპერიმენტულ შედეგებზე.

Მსგავსი პროდუქტები:

China Lnc-RT Heroᵀᴹ I(With gDNase) (სუპერ პრემიქსი პირველი ჯაჭვის cDNA სინთეზისთვის lncRNA-დან) მწარმოებელი და მიმწოდებელი |Foregene (foreivd.com)

ჩინეთი Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman მწარმოებელი და მიმწოდებელი |Foregene (foreivd.com)


გამოქვეყნების დრო: ოქტ-15-2021