• ფეისბუქი
  • linkedin
  • youtube

მოლეკულური დიაგნოსტიკის ტექნოლოგია იყენებს მოლეკულური ბიოლოგიის მეთოდებს ადამიანის სხეულის გენეტიკური მასალისა და სხვადასხვა პათოგენების გამოხატვისა და სტრუქტურის გამოსავლენად, რათა მივაღწიოთ დაავადების პროგნოზირებისა და დიაგნოსტიკის მიზანს.

ბოლო წლებში, მოლეკულური დიაგნოსტიკური ტექნოლოგიის განახლებითა და განმეორებით, მოლეკულური დიაგნოსტიკის კლინიკური გამოყენება უფრო და უფრო ფართო და სიღრმისეული გახდა და მოლეკულური დიაგნოსტიკის ბაზარი შევიდა სწრაფი განვითარების პერიოდში.

ავტორი აჯამებს ბაზარზე არსებულ საერთო მოლეკულური დიაგნოსტიკური ტექნოლოგიებს და იყოფა სამ ნაწილად: პირველ ნაწილში მოცემულია PCR ტექნოლოგია, მეორე ნაწილში მოცემულია ნუკლეინის მჟავას იზოთერმული გამაძლიერებელი ტექნოლოგია, ხოლო მეორე ნაწილში მოცემულია თანმიმდევრობის ტექნოლოგია.

01

ნაწილი I: PCR ტექნოლოგია

PCR ტექნოლოგია

PCR (პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია) არის დნმ-ის გაძლიერების ერთ-ერთი ინ ვიტრო ტექნოლოგია, რომლის ისტორია 30 წელზე მეტია.

PCR ტექნოლოგია იყო პიონერი 1983 წელს Cary Mullis of Cetus, USA.მაულისმა 1985 წელს მიმართა PCR პატენტს და იმავე წელს გამოაქვეყნა პირველი PCR აკადემიური ნაშრომი მეცნიერების შესახებ.მალისმა 1993 წელს მიიღო ნობელის პრემია ქიმიაში.

PCR-ის ძირითადი პრინციპები

PCR-ს შეუძლია სამიზნე დნმ-ის ფრაგმენტების გაძლიერება მილიონზე მეტჯერ.პრინციპი მდგომარეობს იმაში, რომ დნმ პოლიმერაზას კატალიზისას, თარგად გამოიყენება დნმ-ის ძირითადი ჯაჭვი, ხოლო გაფართოების საწყისი წერტილი გამოიყენება სპეციფიკური პრაიმერი.ის მრავლდება ინ ვიტრო საფეხურებით, როგორიცაა დენატურაცია, ანეილირება და გაფართოება.შვილობილი ჯაჭვის დნმ-ის პროცესი, რომელიც ავსებს მშობელი ჯაჭვის დნმ-ის შაბლონს.

1

სტანდარტული PCR პროცესი დაყოფილია სამ ეტაპად:

1. დენატურაცია: გამოიყენეთ მაღალი ტემპერატურა დნმ-ის ორმაგი ჯაჭვების გამოსაყოფად.წყალბადის ბმები დნმ-ის ორმაგ ჯაჭვებს შორის იშლება მაღალ ტემპერატურაზე (93-98°C).

2. ანეილირება: ორჯაჭვიანი დნმ-ის გამოყოფის შემდეგ, ტემპერატურა იკლებს ისე, რომ პრაიმერი შეიძლება დაუკავშირდეს ერთჯაჭვიან დნმ-ს.

3. გაფართოება: დნმ პოლიმერაზა იწყებს დამატებითი ძაფების სინთეზს დნმ-ის ჯაჭვების გასწვრივ შეკრული პრაიმერებიდან, როდესაც ტემპერატურა დაიკლებს.როდესაც გაფართოება დასრულდება, ციკლი სრულდება და დნმ-ის ფრაგმენტების რაოდენობა გაორმაგდება.

ამ სამი ნაბიჯის 25-35-ჯერ გადაბრუნებით, დნმ-ის ფრაგმენტების რაოდენობა ექსპონენტურად გაიზრდება.

2

PCR-ის ინტელექტუალურობა იმაში მდგომარეობს, რომ სხვადასხვა პრაიმერი შეიძლება შეიქმნას სხვადასხვა სამიზნე გენისთვის, ასე რომ სამიზნე გენის ფრაგმენტები შეიძლება გაძლიერდეს მოკლე დროში.

ჯერჯერობით, PCR შეიძლება დაიყოს სამ კატეგორიად, კერძოდ, ჩვეულებრივი PCR, ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR და ციფრული PCR.

ჩვეულებრივი PCR-ის პირველი თაობა

გამოიყენეთ ჩვეულებრივი PCR ამპლიფიკაციის ინსტრუმენტი სამიზნე გენის გასაძლიერებლად, შემდეგ კი გამოიყენეთ აგაროზის გელის ელექტროფორეზი პროდუქტის გამოსავლენად, მხოლოდ ხარისხობრივი ანალიზი შეიძლება გაკეთდეს.

პირველი თაობის PCR-ის ძირითადი უარყოფითი მხარეები:

- მიდრეკილია არასპეციფიკური გაძლიერებისა და ცრუ დადებითი შედეგებისკენ.

-გამოვლენას დიდი დრო სჭირდება და ოპერაცია რთულია.

- მხოლოდ ხარისხობრივი ტესტირება შეიძლება.

მეორე თაობის ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR

ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR (Real-Time PCR), ასევე ცნობილი როგორც qPCR, გამოიყენება გაძლიერებული პროდუქტების დაგროვების მონიტორინგისთვის ფლუორესცენტური სიგნალების დაგროვების გზით ფლუორესცენტური ზონდების დამატებით, რომლებიც შეიძლება მიუთითებდეს რეაქციის სისტემის პროგრესზე და შედეგების განსასჯელად ფლუორესცენტური მრუდის მეშვეობით და ეს შეიძლება იყოს მრუდი C მნიშვნელობის სტანდარტის დახმარებით.

იმის გამო, რომ qPCR ტექნოლოგია ხორციელდება დახურულ სისტემაში, დაბინძურების ალბათობა მცირდება და ფლუორესცენტური სიგნალის მონიტორინგი შესაძლებელია რაოდენობრივი გამოვლენისთვის, ამიტომ ის ყველაზე ფართოდ გამოიყენება კლინიკურ პრაქტიკაში და გახდა დომინანტური ტექნოლოგია PCR-ში.

ფლუორესცენტური ნივთიერებები, რომლებიც გამოიყენება რეალურ დროში ფლუორესცენტურ რაოდენობრივ PCR-ში, შეიძლება დაიყოს: TaqMan ფლუორესცენტურ ზონდებად, მოლეკულურ შუქურებად და ფლუორესცენტურ საღებავებად.

1) TaqMan ფლუორესცენტური ზონდი:

PCR გაძლიერების დროს ემატება სპეციფიკური ფლუორესცენტური ზონდი პრაიმერის წყვილის დამატებისას.ზონდი არის ოლიგონუკლეოტიდი და ორი ბოლო, შესაბამისად, მონიშნულია მომხსენებელი ფლუორესცენტური ჯგუფით და ჩამქრალი ფლუორესცენტური ჯგუფით.

როდესაც ზონდი ხელუხლებელია, რეპორტიორის ჯგუფის მიერ გამოსხივებული ფლუორესცენტური სიგნალი შეიწოვება ჩაქრობის ჯგუფის მიერ;PCR გაძლიერების დროს, Taq ფერმენტის 5'-3' ეგზონუკლეაზური აქტივობა წყვეტს და ანადგურებს ზონდს, ხდის რეპორტიორის ფლუორესცენტულ ჯგუფს და ჩაქრობს. ფლუორესცენციის სიგნალი მთლიანად სინქრონიზებულია PCR პროდუქტის ფორმირებასთან.

2) SYBR ფლუორესცენტური საღებავები:

PCR რეაქციის სისტემაში ემატება SYBR ფლუორესცენტური საღებავის ჭარბი რაოდენობა.მას შემდეგ, რაც SYBR ფლუორესცენტური საღებავი არასპეციფიკურად შედის დნმ-ის ორჯაჭვიანში, ის ასხივებს ფლუორესცენტურ სიგნალს.SYBR საღებავის მოლეკულა, რომელიც არ არის ჩართული ჯაჭვში, არ გამოსცემს ფლუორესცენტურ სიგნალს, რითაც უზრუნველყოფს ფლუორესცენტურ სიგნალს PCR პროდუქტების ზრდა მთლიანად სინქრონიზებულია PCR პროდუქტების ზრდასთან.SYBR უკავშირდება მხოლოდ ორჯაჭვიან დნმ-ს, ამიტომ დნობის მრუდი შეიძლება გამოყენებულ იქნას იმის დასადგენად, არის თუ არა PCR რეაქცია სპეციფიკური.

3 4

3) მოლეკულური შუქურები

ეს არის ღეროვანი მარყუჟის ორმაგი მარკირებული ოლიგონუკლეოტიდური ზონდი, რომელიც ქმნის დაახლოებით 8 ფუძის სტრუქტურას მე-5 და მე-3 ბოლოებზე.ნუკლეინის მჟავების თანმიმდევრობა ორივე ბოლოში არის დაწყვილებული, რაც იწვევს ფლუორესცენტური ჯგუფის და ჩაქრობის ჯგუფს მჭიდროდ.დახურეთ, ის არ გამოიმუშავებს ფლუორესცენციას.

5

PCR პროდუქტის გენერირების შემდეგ, ანეილირების პროცესის დროს, მოლეკულური შუქურის შუა ნაწილი წყვილდება დნმ-ის სპეციფიკურ თანმიმდევრობასთან და ფლუორესცენტური გენი გამოყოფილია ჩამქრალი გენისაგან ფლუორესცენციის წარმოქმნით.

6

მეორე თაობის PCR-ის ძირითადი უარყოფითი მხარეები:

მგრძნობელობა ჯერ კიდევ აკლია და დაბალი ასლის ნიმუშების აღმოჩენა ზუსტი არ არის.

არსებობს ფონური მნიშვნელობის გავლენა და შედეგი ექვემდებარება ჩარევას.

მესამე თაობის ციფრული PCR

ციფრული PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) ითვლის სამიზნე თანმიმდევრობის ასლის რაოდენობას ბოლო წერტილის გამოვლენის გზით და შეუძლია შეასრულოს ზუსტი აბსოლუტური რაოდენობრივი გამოვლენა შიდა კონტროლისა და სტანდარტული მრუდების გამოყენების გარეშე.

ციფრული PCR იყენებს საბოლოო წერტილის გამოვლენას და არ არის დამოკიდებული Ct მნიშვნელობაზე (ციკლის ბარიერი), ამიტომ ციფრული PCR რეაქციაზე ნაკლებად მოქმედებს გაძლიერების ეფექტურობა და PCR რეაქციის ინჰიბიტორების მიმართ ტოლერანტობა გაუმჯობესებულია, მაღალი სიზუსტით და გამეორებით.

მაღალი მგრძნობელობისა და მაღალი სიზუსტის მახასიათებლების გამო, მას ადვილად არ ერევა PCR რეაქციის ინჰიბიტორები და მას შეუძლია მიაღწიოს ნამდვილ აბსოლუტურ რაოდენობებს სტანდარტული პროდუქტების გარეშე, რაც გახდა კვლევისა და გამოყენების ცხელ წერტილად.

რეაქციის ერთეულის სხვადასხვა ფორმის მიხედვით, ის შეიძლება დაიყოს სამ ტიპად: მიკროსთხევად, ჩიპურ და წვეთოვან სისტემებად.


გამოქვეყნების დრო: ივლის-08-2021