• ფეისბუქი
  • linkedin
  • youtube

PCR არის ყველაზე ფართოდ გამოყენებული ნუკლეინის მჟავების ამპლიფიკაციის ტექნოლოგია და ფართოდ გამოიყენება მისი მგრძნობელობისა და სპეციფიკის გამო.თუმცა, PCR მოითხოვს განმეორებით თერმულ დენატურაციას და ვერ ათავისუფლებს ინსტრუმენტებსა და აღჭურვილობაზე დაყრდნობის შეზღუდვებს, რაც ზღუდავს მის გამოყენებას კლინიკურ საველე ტესტირებაში.

1990-იანი წლების დასაწყისიდან ბევრმა ლაბორატორიამ დაიწყო მუდმივი ტემპერატურის გამაძლიერებელი ტექნოლოგიის შემუშავება, რომელიც არ საჭიროებს თერმულ დენატურაციას.ახლა მათ შეიმუშავეს მარყუჟის შუამავლობით იზოთერმული გამაძლიერებელი ტექნოლოგია, ძაფების ჩანაცვლების იზოთერმული გაძლიერების ტექნოლოგია, მოძრავი წრის იზოთერმული გაძლიერების ტექნოლოგია და ნუკლეინის მჟავების თანმიმდევრობით დამოკიდებულება.იზოთერმული გამაძლიერებელი ტექნოლოგია და სხვა ტექნოლოგიები. 

Loop შუამავლობით იზოთერმული გაძლიერება

ამპლიფიკაციის პრინციპი ეფუძნება იმ ფაქტს, რომ დნმ არის დინამიურ წონასწორობაში დაახლოებით 65°C ტემპერატურაზე.როდესაც ნებისმიერი პრაიმერი ფუძე-დაწყვილდება და ვრცელდება ორჯაჭვიანი დნმ-ის დამატებით ნაწილზე, მეორე ჯაჭვი დაიშლება და გახდება ერთჯაჭვიანი.

ამ ტემპერატურაზე, დნმ იყენებს 4 სპეციფიკურ პრაიმერს, რათა დაეყრდნოს ჯაჭვის გადაადგილების დნმ-ის პოლიმერაზას, რათა ჯაჭვის გადაადგილების დნმ-ის სინთეზი განუწყვეტლივ თვითცირკულირდეს.

ჯერ განსაზღვრეთ 6 სპეციფიკური რეგიონი F3, F2, F1, B1, B2, B3 სამიზნე გენზე და შემდეგ შეიმუშავეთ 4 პრაიმერი ამ 6 სპეციფიკური რეგიონის საფუძველზე (როგორც ნაჩვენებია ქვემოთ მოცემულ სურათზე):

წინა შიდა პრაიმერი (FIP) შედგება F1c და F2-ისგან.

უკანა შიდა პრაიმერი (BIP) შედგება B1c და B2-ისგან, ხოლო TTTT გამოიყენება შუაში შუაში.

გარე პრაიმერები F3 და B3 შესაბამისად შედგება F3 და B3 რეგიონებისგან სამიზნე გენზე.

ნუკლეინის მჟავას იზოთერმული გაძლიერების ტექნოლოგია

LAMP რეაქციის სისტემაში შიდა პრაიმერის კონცენტრაცია რამდენჯერმე აღემატება გარე პრაიმერის კონცენტრაციას.შიდა პრაიმერი პირველად შერწყმულია შაბლონის ჯაჭვთან, რათა მოხდეს დამატებითი ჯაჭვის სინთეზირება დნმ-ის ორმაგი ჯაჭვის შესაქმნელად.შემდგომში, გარე პრაიმერი შერწყმულია შაბლონის ჯაჭვთან, რათა შეიქმნას დნმ-ის ორმაგი ჯაჭვი.BstDNA პოლიმერაზას მოქმედებით იხსნება შიდა პრაიმერის მიერ სინთეზირებული დამატებითი ჯაჭვი.რეაქციების სერიის შემდეგ, დამატებითი ჯაჭვი საბოლოოდ ქმნის დნმ-ის ერთ ჯაჭვს ჰანტელის სტრუქტურით.

ჰანტელის სტრუქტურის დნმ-ის ცალკეული ჯაჭვი თავად გამოიყენება შაბლონად, რათა განუწყვეტლივ ჩამოყალიბდეს გარდამავალი ღეროვანი მარყუჟის სტრუქტურის დნმ ღია ბოლოთი.შიდა და გარე პრაიმერები ხელმძღვანელობენ გარდამავალი ღეროვანი მარყუჟის სტრუქტურის დნმ-ს, რათა განუწყვეტლივ განიცადოს ძაფების გადაადგილება და გაფართოების რეაქციები და საბოლოოდ ქმნიან ღერო-მარყუჟის მრავალ სტრუქტურას სხვადასხვა სიგრძით.დნმ ნარევი.

ნუკლეინის მჟავას იზოთერმული გაძლიერების ტექნოლოგია2

მარყუჟის შუამავლობით იზოთერმული გაძლიერების უპირატესობები და უარყოფითი მხარეები

LAMP-ის უპირატესობები:

(1) ამპლიფიკაციის მაღალი ეფექტურობა, რომელსაც შეუძლია ეფექტურად გააძლიეროს სამიზნე გენის 1-10 ასლი 1 სთ-ში და გაძლიერების ეფექტურობა 10-100-ჯერ აღემატება ჩვეულებრივ PCR-ს.

(2) რეაქციის დრო მოკლეა, სპეციფიკა ძლიერია და სპეციალური აღჭურვილობა არ არის საჭირო.

LAMP-ის ნაკლოვანებები:

(1) მოთხოვნები პრაიმერებზე განსაკუთრებით მაღალია.

(2) გაძლიერებული პროდუქტი არ შეიძლება გამოყენებულ იქნას კლონირებისა და თანმიმდევრობისთვის, მაგრამ შეიძლება გამოყენებულ იქნას მხოლოდ განსჯისთვის.

(3) მისი ძლიერი მგრძნობელობის გამო, ადვილია აეროზოლების ფორმირება, რაც იწვევს ცრუ დადებით შედეგებს და გავლენას ახდენს ტესტის შედეგებზე.

Sტრენდის გადაადგილების გაძლიერება

ძაფების გადაადგილების გაძლიერება (SDA) არის ინ ვიტრო იზოთერმული დნმ-ის გაძლიერების ტექნიკა, რომელიც დაფუძნებულია ფერმენტულ რეაქციაზე, რომელიც პირველად შემოგვთავაზა ამერიკელმა მეცნიერმა უოკერმა 1992 წელს.

SDA-ს ძირითადი სისტემა მოიცავს რესტრიქციულ ენდონუკლეაზას, დნმ პოლიმერაზას ჯაჭვის გადაადგილების აქტივობით, პრაიმერის ორ წყვილს, dNTP-ებს და კალციუმის და მაგნიუმის იონებს და ბუფერულ სისტემებს.

ჯაჭვის გადაადგილების გაძლიერების პრინციპი ეფუძნება ქიმიურად მოდიფიცირებულ შეზღუდვის ენდონუკლეაზას ამოცნობის თანმიმდევრობას სამიზნე დნმ-ის ორივე ბოლოში.ენდონუკლეაზა ხსნის უფსკრული ძაფების დნმ-ში მის ამოცნობის ადგილზე, ხოლო დნმ პოლიმერაზა აგრძელებს უფსკრული 3' ბოლოს და ცვლის დნმ-ის შემდეგ ჯაჭვს.

შეცვლილი დნმ-ის ერთი ჯაჭვები შეიძლება გაერთიანდეს პრაიმერებთან და გაგრძელდეს ორმაგ ძაფებად დნმ პოლიმერაზას საშუალებით.ეს პროცესი მუდმივად მეორდება, რათა სამიზნე თანმიმდევრობა ეფექტურად გაძლიერდეს.

ნუკლეინის მჟავას იზოთერმული გაძლიერების ტექნოლოგია3

ძაფების გადაადგილების გამაძლიერებელი ტექნოლოგიის უპირატესობები და უარყოფითი მხარეები

SDA-ს უპირატესობები:

გაძლიერების ეფექტურობა მაღალია, რეაქციის დრო მოკლეა, სპეციფიკა ძლიერია და არ არის საჭირო სპეციალური აღჭურვილობა.

SDA-ს ნაკლოვანებები:

პროდუქტები არ არის ერთგვაროვანი და ზოგიერთი ერთჯაჭვიანი და ორჯაჭვიანი პროდუქტი ყოველთვის იწარმოება SDA ციკლში და ელექტროფორეზით გამოვლენისას აუცილებლად მოხდება კუდის დაგროვება.

Rolling წრის გაძლიერება

მოძრავი წრის გაძლიერება (RCA) შემოთავაზებულია პათოგენური ორგანიზმების დნმ-ის კოპირების მეთოდის გამოყენებით მოძრავი წრის საშუალებით.ეს ეხება ერთჯაჭვიანი წრიული დნმ-ის, როგორც შაბლონის გამოყენებას მუდმივ ტემპერატურაზე, და სპეციალური დნმ პოლიმერაზას (როგორიცაა Phi29) ) მოძრავი წრის დნმ-ის სინთეზის მოქმედების ქვეშ სამიზნე გენის გაძლიერების მისაღწევად.

RCA შეიძლება დაიყოს ხაზოვან და ექსპონენციალურ გაძლიერებად.ხაზოვანი RCA-ს ეფექტურობა შეიძლება მიაღწიოს 10-ს5ჯერ და ექსპონენციური RCA-ს ეფექტურობამ შეიძლება მიაღწიოს 10-ს9ჯერ.

მარტივი განსხვავება, როგორც ნაჩვენებია ქვემოთ მოცემულ სურათზე, წრფივი გაძლიერება a იყენებს მხოლოდ 1 პრაიმერს, ექსპონენციალურ გაძლიერებას b აქვს 2 პრაიმერი.

ნუკლეინის მჟავას იზოთერმული გაძლიერების ტექნოლოგია4

ხაზოვან RCA-ს ასევე უწოდებენ ერთჯერადი პრაიმერის RCA.პრაიმერი უკავშირდება წრიულ დნმ-ს და ვრცელდება დნმ პოლიმერაზას მოქმედებით.პროდუქტი არის წრფივი ერთჯერადი ძაფები, დიდი რაოდენობით განმეორებადი თანმიმდევრობით, რომელიც ათასჯერ აღემატება ერთი მარყუჟის სიგრძეს.

ვინაიდან ხაზოვანი RCA-ს პროდუქტი ყოველთვის დაკავშირებულია საწყის პრაიმერთან, სიგნალის მარტივი ფიქსაცია მთავარი უპირატესობაა.

ექსპონენციური RCA, ასევე ცნობილი, როგორც ჰიპერ განშტოებული გაძლიერება HRCA (Hyper branched RCA), ექსპონენციურ RCA-ში, ერთი პრაიმერი აძლიერებს RCA პროდუქტს, მეორე პრაიმერი ჰიბრიდირებულია RCA პროდუქტთან და ვრცელდება, და ჩანაცვლება უკვე დაკავშირებულია RCA პროდუქტთან. ქვედა დინების პრაიმერები აფართოებენ ძაფს და იმეორებენ გაფართოებას და ჩანაცვლებას RCA პროდუქტის შესაქმნელად.

ნუკლეინის მჟავას იზოთერმული გაძლიერების ტექნოლოგია5

მოძრავი წრის ნუკლეინის მჟავას გაძლიერების უპირატესობები და უარყოფითი მხარეები

RCA-ს უპირატესობები:

მაღალი მგრძნობელობა, კარგი სპეციფიკა და მარტივი ოპერაცია.

RCA-ს ნაკლოვანებები:

ფონური პრობლემები სიგნალის გამოვლენისას.RCA რეაქციის დროს, არაცირკულირებადი ბოქლომის ზონდი და დნმ-ის ან რნმ-ის შაბლონი შეუკავშირებელი ზონდის შეიძლება წარმოქმნას გარკვეული ფონური სიგნალები. 

Nუკლეიკაციდების თანმიმდევრობაზე დაფუძნებული გაძლიერება

ნუკლეინის მჟავას თანმიმდევრობით დაფუძნებული ამპლიფიკაცია (NASBA) არის ახალი ტექნოლოგია, რომელიც შემუშავებულია PCR-ის საფუძველზე.ეს არის უწყვეტი და იზოთერმული ნუკლეინის მჟავის გაძლიერება, რომელსაც ხელმძღვანელობს პრაიმერების წყვილი T7 პრომოტორული თანმიმდევრობით.ტექნოლოგიას შეუძლია თარგის რნმ-ის გაძლიერება დაახლოებით 109-ჯერ დაახლოებით 2 საათის განმავლობაში, რაც 1000-ჯერ აღემატება ჩვეულებრივ PCR მეთოდს და არ საჭიროებს სპეციალურ აღჭურვილობას.

ეს ტექნოლოგია გამოიყენებოდა დაავადების სწრაფი დიაგნოსტიკისთვის მისი გამოჩენისთანავე და ბევრი კომპანია ამჟამად იყენებს ამ მეთოდს რნმ-ის გამოვლენის კომპლექტებში.

მიუხედავად იმისა, რომ რნმ-ის გაძლიერება ასევე შეიძლება გამოიყენოს საპირისპირო ტრანსკრიფციის PCR ტექნოლოგია, NASBA-ს აქვს საკუთარი უპირატესობები: ის შეიძლება განხორციელდეს შედარებით მუდმივი ტემპერატურის პირობებში და ის უფრო სტაბილური და ზუსტია, ვიდრე ტრადიციული PCR ტექნოლოგია.

რეაქცია არის 41 გრადუს ცელსიუსზე და დასჭირდება AMV (ფრინველის მიელობლასტოზის ვირუსი) საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა, RNase H, T7 RNA პოლიმერაზა და წყვილი პრაიმერი.

პროცესი ძირითადად მოიცავს:

წინა პრაიმერი შეიცავს T7 პრომოტორის დამატებით თანმიმდევრობას.რეაქციის დროს, წინა პრაიმერი უკავშირდება რნმ-ის ჯაჭვს და კატალიზდება AMV ფერმენტის მიერ დნმ-რნმ ორმაგი ჯაჭვის წარმოქმნით.

RNase H შლის რნმ-ს ჰიბრიდულ ორჯაჭვიანში და ინარჩუნებს ერთჯაჭვიან დნმ-ს.

საპირისპირო პრაიმერის და AMV ფერმენტის მოქმედებით წარმოიქმნება დნმ-ის ორმაგი ჯაჭვი, რომელიც შეიცავს T7 პრომოტორის თანმიმდევრობას.

T7 რნმ პოლიმერაზას მოქმედებით სრულდება ტრანსკრიფციის პროცესი და წარმოიქმნება დიდი რაოდენობით სამიზნე რნმ.

ნუკლეინის მჟავას იზოთერმული გაძლიერების ტექნოლოგია6

NASBA-ს უპირატესობები:

(1) მის პრაიმერს აქვს T7 პრომოტორული თანმიმდევრობა, მაგრამ უცხო ორჯაჭვიან დნმ-ს არ აქვს T7 პრომოტორის თანმიმდევრობა და მისი გაძლიერება შეუძლებელია, ამიტომ ამ ტექნოლოგიას აქვს მაღალი სპეციფიკა და მგრძნობელობა.

(2) NASBA პირდაპირ აერთიანებს საპირისპირო ტრანსკრიფციის პროცესს ამპლიფიკაციის რეაქციაში, რაც ამცირებს რეაქციის დროს.

NASBA-ს უარყოფითი მხარეები:

(1) რეაქციის კომპონენტები უფრო რთულია.

(2) სამი სახის ფერმენტია საჭირო, რომ რეაქციის ფასი უფრო მაღალი იყოს.


გამოქვეყნების დრო: აგვისტო-06-2021