რამდენიმე რევოლუციური გამოგონება გამოვლენის ტექნოლოგიის ისტორიაში, ჩემი აზრით, არის იმუნო მარკირების ტექნოლოგია, რომელიც დაფუძნებულია ანტიგენ-ანტისხეულების სპეციფიკური შეკავშირების პრინციპზე, PCR ტექნოლოგიაზე და თანმიმდევრობის ტექნოლოგიაზე.დღეს ჩვენ ვისაუბრებთ PCR ტექნოლოგიაზე.PCR ტექნოლოგიის ევოლუციის მიხედვით, ადამიანები ჩვეულებრივ ყოფენ PCR ტექნოლოგიას სამ თაობად: ჩვეულებრივი PCR ტექნოლოგია, რეალურ დროში ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR ტექნოლოგია და ციფრული PCR ტექნოლოგია.
Cჩვეულებრივი PCR ტექნიკა
KARY MULLIS (1944.12.28-2019.8.7)
კარი მალისმა გამოიგონა პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია (პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია, PCR) 1983 წელს. ამბობენ, რომ როდესაც ის მართავდა თავის შეყვარებულს, მას მოულოდნელად გაუჩნდა შთაგონება და დაფიქრდა PCR-ის პრინციპზე (მანქანის სარგებლობის შესახებ).კარი მალისს მიენიჭა ნობელის პრემია ქიმიაში 1993 წელს. ნიუ-იორკ თაიმსმა კომენტარი გააკეთა: „უაღრესად ორიგინალური და მნიშვნელოვანი, თითქმის ყოფს ბიოლოგიას PCR-მდე და PCR-ის შემდგომ პერიოდებად.
PCR-ის პრინციპი: დნმ პოლიმერაზას კატალიზის დროს, დედა ჯაჭვის დნმ გამოიყენება შაბლონად, ხოლო სპეციფიკური პრაიმერი გამოიყენება გაფართოების საწყის წერტილად, ხოლო შვილობილი ჯაჭვის დნმ-ის დამატებითი კოპირება ხდება დენატურაციის, ანეილირების, გაფართოებისა და სხვა საფეხურების მეშვეობით.ეს არის დნმ-ის სინთეზის ამპლიფიკაციის ტექნოლოგია in vitro, რომელსაც შეუძლია სწრაფად და კონკრეტულად გააძლიეროს ნებისმიერი სამიზნე დნმ in vitro.
ჩვეულებრივი PCR-ის უპირატესობები
1.კლასიკური მეთოდი, სრული საერთაშორისო და შიდა სტანდარტები
2.ინსტრუმენტის რეაგენტების დაბალი ღირებულება
3.PCR პროდუქტების აღდგენა შესაძლებელია სხვა მოლეკულური ბიოლოგიის ექსპერიმენტებისთვის
რეკომენდებული Foregene PCR მანქანა: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
დაკავშირებული პროდუქტები: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
ჩვეულებრივი PCR-ის ნაკლოვანებები
1.ადვილად დასაბინძურებელი
2.უხერხული ოპერაცია
3.მხოლოდ თვისებრივი ანალიზი
4.ზომიერი მგრძნობელობა
5.არის არასპეციფიკური გაძლიერება და როდესაც არასპეციფიკური ზოლი იგივე ზომისაა, როგორც სამიზნე ზოლი, მისი გარჩევა შეუძლებელია
Cაპილარული ელექტროფორეზის საფუძველზე PCR
ჩვეულებრივი PCR-ის ნაკლოვანებების საპასუხოდ, ზოგიერთმა მწარმოებელმა შემოიტანა ინსტრუმენტები, რომლებიც დაფუძნებულია კაპილარული ელექტროფორეზის პრინციპზე.ელექტროფორეზის ეტაპი PCR გაძლიერების შემდეგ სრულდება კაპილარში.მგრძნობელობა უფრო მაღალია და შეიძლება გამოირჩეოდეს რამდენიმე ბაზის განსხვავება და გაძლიერება გამოითვალოს MAERKER-ით.პროდუქტის შინაარსი.მინუსი არის ის, რომ PCR პროდუქტის გახსნა და ინსტრუმენტში ჩასმა მაინც საჭიროა და დაბინძურების დიდი რისკი მაინც არსებობს.
CაპილარულიEელექტროფორეზი
2. რეალურ დროში ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR (Quantitative Real-time PCR, qPCR) ტექნოლოგიაფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR, ასევე მოუწოდა Real-Time PCR, არის ახალი ნუკლეინის მჟავების რაოდენობრივი ტექნოლოგია, რომელიც შემუშავებულია PE (Perkin Elmer) მიერ 1995 წელს. ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR-ის განვითარების ისტორია არის გიგანტების სულისშემძვრელი ბრძოლის ისტორია, როგორიცაა ABI, Roche და Bio-Rad.თუ გაინტერესებთ, შეგიძლიათ შეამოწმოთ იგი.ეს ტექნიკა ამჟამად არის ყველაზე მომწიფებული და ფართოდ გამოყენებული ნახევრად რაოდენობრივი PCR ტექნიკა.
რეკომენდებული qPCR მანქანა:https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/
ფლუორესცენტური საღებავის მეთოდი (SYBR Green I):SYBR Green I არის ყველაზე ხშირად გამოყენებული დნმ-შემაკავშირებელი საღებავი რაოდენობრივი PCR-ისთვის, რომელიც არასპეციფიკურად უკავშირდება ორჯაჭვიან დნმ-ს.თავისუფალ მდგომარეობაში, SYBR Green ასხივებს სუსტ ფლუორესცენციას, მაგრამ ორჯაჭვიან დნმ-თან შეერთების შემდეგ მისი ფლუორესცენცია 1000-ჯერ იზრდება.ამრიგად, რეაქციის შედეგად გამოსხივებული მთლიანი ფლუორესცენტური სიგნალი პროპორციულია ორჯაჭვიანი დნმ-ის ოდენობისა და გაიზრდება გაძლიერებული პროდუქტის მატებასთან ერთად.ვინაიდან საღებავი არასპეციფიკურად აკავშირებს ორჯაჭვიან დნმ-ს, შეიძლება ცრუ დადებითი შედეგები იყოს გენერირებული.
დაკავშირებული პროდუქტები: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/
ფლუორესცენტური ზონდის მეთოდი (Taqman ტექნოლოგია): დროსPCR გაძლიერება, სპეციფიკური ფლუორესცენტური ზონდი ემატება პრაიმერების წყვილთან ერთად.ზონდი არის წრფივი ოლიგონუკლეოტიდი, ფლუორესცენტური მომხსენებელი ჯგუფით და ფლუორესცენტური ჩამქრალი ჯგუფით, შესაბამისად, ორივე ბოლოზე.როდესაც ზონდი ხელუხლებელია, რეპორტიორის ჯგუფის მიერ გამოსხივებული ფლუორესცენტური სიგნალი შეიწოვება ჩამქრალი ჯგუფის მიერ და გამოვლენა არ არის ფლუორესცენტური სიგნალი;PCR გაძლიერების დროს (გაფართოების ეტაპზე), Taq ფერმენტის 5'-3' Dicer აქტივობა შეიწოვება და დეგრადირებს ზონდს, ისე, რომ მომხსენებელი ფლუორესცენტური ჯგუფი და ჩამქრალი ფლუორესცენტური ჯგუფი განცალკევდება, რათა ფლუორესცენტური მონიტორინგის სისტემა მიღებულ იქნეს ფლუორესცენტური სიგნალი. ფლუორესცენტური სიგნალების დაგროვების სინქრონიზაცია და PCR პროდუქტების ფორმირება.Taqman ზონდის მეთოდი არის ყველაზე ხშირად გამოყენებული გამოვლენის მეთოდი კლინიკურ გამოვლენაში.
დაკავშირებული პროდუქტები: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/
qPCR-ის უპირატესობები
1.მეთოდი მომწიფებულია და დამხმარე აღჭურვილობა და რეაგენტები დასრულებულია
2.რეაგენტების საშუალო ღირებულება
3.ადვილად გამოსაყენებელი
4.მაღალი გამოვლენის მგრძნობელობა და სპეციფიკა
qPCR-ის უარყოფითი მხარეები
სამიზნე გენის მუტაცია იწვევს გამოტოვებულ აღმოჩენას.
დაბალი კონცენტრაციის შაბლონის გამოვლენის შედეგის დადგენა შეუძლებელია.
რაოდენობრივი გამოვლენისთვის სტანდარტული მრუდის გამოყენებისას დიდი შეცდომაა.
3. ციფრული PCR (digital PCR, dPCR) ტექნოლოგია
ციფრული PCR არის ნუკლეინის მჟავის მოლეკულების აბსოლუტური რაოდენობრივი განსაზღვრის ტექნიკა.qPCR-თან შედარებით, ციფრულ PCR-ს შეუძლია პირდაპირ წაიკითხოს დნმ/რნმ-ის მოლეკულების რაოდენობა, რაც არის ნუკლეინის მჟავის მოლეკულების აბსოლუტური რაოდენობრივი მაჩვენებელი საწყის ნიმუშში.1999 წელს ბერტ ვოგელშტეინმა და კენეტ ვ. კინ-ზლერმა ოფიციალურად შემოგვთავაზეს dPCR კონცეფცია.
2006 წელს Fluidigm იყო პირველი, ვინც აწარმოა კომერციული ჩიპზე დაფუძნებული dPCR ინსტრუმენტი.2009 წელს Life Technologies-მა გამოუშვა OpenArray და QuantStudio 12K Flex dPCR სისტემები.2013 წელს Life Technologies-მა გამოუშვა QuantStudio 3DdPCR სისტემა, რომელიც იყენებს მაღალი სიმკვრივის ნანომასშტაბიანი მიკროსთხევადი ჩიპის ტექნოლოგიას ნიმუშების თანაბრად გადანაწილებისთვის 20000 ცალკეულ უჯრედში.რეაქციაში კარგად.
2011 წელს, Bio-Rad-მა გამოუშვა წვეთებზე დაფუძნებული QX100 dPCR ინსტრუმენტი, რომელიც იყენებს ზეთში წყლის ტექნოლოგიას, რათა თანაბრად გადაანაწილოს ნიმუში 20000 წვეთი-წყალ-ზეთში და იყენებს წვეთების ანალიზატორს წვეთების გასაანალიზებლად.2012 წელს RainDance-მა გამოუშვა RainDrop dPCR ინსტრუმენტი, რომელსაც მართავს მაღალი წნევის გაზი, რათა დაყოს თითოეული სტანდარტული რეაქციის სისტემა რეაქციულ ემულსიად, რომელიც შეიცავს 1 მილიონიდან 10 მილიონ პიკოლიტრის დონის მიკრო წვეთებს.
ჯერჯერობით, ციფრულმა PCR-მ ჩამოაყალიბა ორი ძირითადი ფრაქცია, ჩიპის ტიპი და წვეთოვანი ტიპი.არ აქვს მნიშვნელობა რა სახის ციფრული PCR, მისი ძირითადი პრინციპებია განზავების შეზღუდვა, საბოლოო წერტილი PCR და პუასონის განაწილება.სტანდარტული PCR რეაქციის სისტემა, რომელიც შეიცავს ნუკლეინის მჟავას შაბლონებს, თანაბრად იყოფა ათიათასობით PCR რეაქციად, რომლებიც ნაწილდება ჩიპებზე ან მიკროწვეთებზე, ისე, რომ თითოეული რეაქცია შეძლებისდაგვარად შეიცავს შაბლონის მოლეკულას და ტარდება ერთმოლეკულიანი შაბლონის PCR რეაქცია.ფლუორესცენციის წაკითხვით ითვლება სიგნალის არსებობა ან არარსებობა და აბსოლუტური რაოდენობრივი განსაზღვრა ხდება სტატისტიკური პუასონის განაწილების დაკალიბრების შემდეგ.
ქვემოთ მოცემულია რამდენიმე ციფრული PCR პლატფორმის მახასიათებლები, რომლებიც მე გამოვიყენე:
1. Bio-Rad QX200 წვეთოვანი ციფრული PCR Bio-RadQX200 არის ძალიან კლასიკური ციფრული PCR პლატფორმა, გამოვლენის ძირითადი პროცესი: წვეთების გენერატორის მიერ გენერირდება 20,000 ნიმუში წყლის ზეთში მიკრო წვეთები გაძლიერებულია ჩვეულებრივ PCR აპარატზე და ბოლოს თითოეული მიკრო წვეთების ფლუორესცენციული სიგნალი იკითხება მიკრო წვეთების მკითხველით.ოპერაცია უფრო რთულია და დაბინძურების რისკი საშუალოა.
Xinyi TD1 მიკრო-წვეთოვანი ციფრული PCRXinyi TD1 არის შიდა ციფრული PCR პლატფორმა, გამოვლენის ძირითადი პროცესი: წვეთების გენერატორის მეშვეობით წარმოქმნის 30,000-50,000 წვეთს წყლის ზეთში, გაძლიერდება საერთო PCR ინსტრუმენტზე და ბოლოს გადასცემს წვეთების წამკითხველი კითხულობს თითოეული წვეთის ფლუორესცენტურ სიგნალს.წვეთების წარმოქმნა და კითხვა ამ პლატფორმაზე შესრულებულია სპეციალურ ჩიპში დაბინძურების დაბალი რისკით.
STILLA Naica მიკრო-წვეთოვანი ჩიპი ციფრული PCRSTILLA Naica არის შედარებით ახალი ციფრული PCR პლატფორმა.გამოვლენის ძირითადი პროცესია: დაამატეთ რეაქციის ხსნარი ჩიპში, ჩადეთ ჩიპი მიკრო წვეთების წარმოქმნისა და გაძლიერების სისტემაში და წარმოქმნით 30000 მიკრო წვეთს.ვრცელდება ჩიპზე და ჩიპზე სრულდება PCR გაძლიერება.შემდეგ გაძლიერებული ჩიპი გადადის მიკრო წვეთების წაკითხვის ანალიზის სისტემაში, ხოლო ფლუორესცენტური სიგნალი იკითხება სურათების გადაღებით.ვინაიდან მთელი პროცესი დახურულ ჩიპში მიმდინარეობს, დაბინძურების რისკი დაბალია.
4. ThermoFisher QuantStudio 3D ჩიპი ციფრული PCR
ThermoFisher QuantStudio 3D არის კიდევ ერთი კლასიკური ჩიპზე დაფუძნებული ციფრული PCR პლატფორმა.მისი გამოვლენის ძირითადი პროცესია: დაამატეთ რეაქციის ხსნარი გამავრცელებელში და სარეაქციო ხსნარი თანაბრად გაანაწილეთ ჩიპზე 20 000 მიკროჭის მეშვეობით გამავრცელებელში.დადეთ ჩიპი PCR აპარატზე გასაძლიერებლად და ბოლოს ჩადეთ ჩიპი მკითხველში და გადაიღეთ ფოტო ფლუორესცენტური სიგნალის წასაკითხად.ოპერაცია შედარებით რთულია და მთელი პროცესი დახურულ ჩიპში მიმდინარეობს და დაბინძურების რისკი დაბალია.
5. JN MEDSYS Clarity ჩიპი ციფრული PCR
JN MEDSYS Clarity არის შედარებით ახალი ჩიპის ტიპის ციფრული PCR პლატფორმა.მისი გამოვლენის ძირითადი პროცესია: დაამატეთ რეაქციის ხსნარი აპლიკატორში და თანაბრად გაანაწილეთ რეაქციის ხსნარი 10000 PCR მილზე, რომელიც ფიქსირდება PCR მილში აპლიკატორის მეშვეობით.მიკროფოროვან ჩიპზე რეაქციის ხსნარი შედის ჩიპში კაპილარული მოქმედებით, ხოლო PCR მილი ჩიპთან ერთად მოთავსებულია PCR აპარატზე გასაძლიერებლად და ბოლოს ჩიპი ჩადის მკითხველში, რათა წაიკითხოს ფლუორესცენტური სიგნალი ფოტოს გადაღებით.ოპერაცია უფრო რთულია.დაბინძურების რისკი დაბალია.
თითოეული ციფრული PCR პლატფორმის პარამეტრები შეჯამებულია შემდეგნაირად:
ციფრული PCR პლატფორმის შეფასების ინდიკატორებია: გაყოფილი ერთეულების რაოდენობა, ფლუორესცენტური არხების რაოდენობა, მუშაობის სირთულე და დაბინძურების რისკი.მაგრამ ყველაზე მნიშვნელოვანი არის გამოვლენის სიზუსტე.ციფრული PCR პლატფორმების შეფასების ერთი გზაა მრავალი ციფრული PCR პლატფორმის გამოყენება ერთმანეთის შესამოწმებლად და მეორე გზა არის სტანდარტული ნივთიერებების გამოყენება ზუსტი მნიშვნელობებით.
dPCR-ის უპირატესობები
1.აბსოლუტური რაოდენობების მიღწევა
2.უფრო მაღალი მგრძნობელობა და სპეციფიკა
3.შეუძლია აღმოაჩინოს დაბალი ასლი ნიმუშები
dPCR-ის უარყოფითი მხარეები1. ძვირადღირებული აღჭურვილობა და რეაგენტები 2. რთული ოპერაცია და ხანგრძლივი გამოვლენის დრო 3. აღმოჩენის ვიწრო დიაპაზონი
ამჟამად, PCR ტექნოლოგიის სამ თაობას აქვს საკუთარი დადებითი და უარყოფითი მხარეები და თითოეულს აქვს საკუთარი განაცხადის სფეროები და ეს არ არის ურთიერთობა, რომ ერთი თაობა ანაცვლებს მეორეს.ტექნოლოგიის უწყვეტმა წინსვლამ შესძინა ახალი სიცოცხლისუნარიანობა PCR ტექნოლოგიაში, რაც საშუალებას აძლევს მას განბლოკოს განაცხადის ერთი მიმართულება მეორის მიყოლებით, რაც ნუკლეინის მჟავას გამოვლენას უფრო მოსახერხებელი და ზუსტი გახდის.
წყარო: დოქტორი იუანი მიგიყვანთ ტესტირებისთვის
რეკომენდებული პროდუქტები:
გამოქვეყნების დრო: ნოე-18-2022
