COVID-19 არის ინფექციური დაავადება, რომელიც გამოწვეულია მძიმე მწვავე რესპირატორული სინდრომით, ტიპი 2, კორონავირუსით. როდესაც ადამიანი ინფიცირებულია, ყველაზე გავრცელებული სიმპტომებია ცხელება, ხველა და ქოშინი.

ტესტირებისთვის გამოყენებული ნიმუშები შეიძლება შეგროვდეს ცხვირ-ხახის ან ოროფარინგეალური ნაცხის საშუალებით.

რა არის PCR?

კორონავირუსის გამოვლენის სტანდარტული მეთოდია პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია, PCR.ეს არის მეთოდი, რომელიც ფართოდ გამოიყენება მოლეკულურ ბიოლოგიაში.მას შეუძლია სწრაფად დააკოპიროს მილიონობით მილიარდობით კონკრეტული დნმ-ის ფრაგმენტები.

ახალი კორონავირუსი შეიცავს ძალიან გრძელ ერთჯაჭვიან რნმ გენომს.PCR-ით ამ ვირუსების გამოსავლენად, რნმ-ის მოლეკულები უნდა გარდაიქმნას მათ დამატებით დნმ-ის თანმიმდევრობებში საპირისპირო ტრანსკრიპტაზას საშუალებით და შემდეგ ახლად სინთეზირებული დნმ შეიძლება გაძლიერდეს სტანდარტული PCR პროცედურების საშუალებით, რომელიც საყოველთაოდ ცნობილია როგორც RT-PCR.

RT-PCR პროცესი

რნმ-ის ექსტრაქცია

ამ მეთოდის შესასრულებლად, ვირუსული რნმ ძირითადად უნდა გამოიყოს.რნმ-ის გამწმენდის სხვადასხვა ნაკრები შეიძლება გამოყენებულ იქნას მოსახერხებელი, სწრაფი და ეფექტური განცალკევებისთვის.

კომერციული ნაკრების გამოყენებით ვირუსული რნმ-ის ამოსაღებად, ჯერ დაამატეთ ნიმუში მიკროცენტრიფუგის მილში და შემდეგ აურიეთ იგი ლიზის ბუფერთან.ეს ბუფერი ძლიერ დენატურირებულია და ჩვეულებრივ შედგება ფენოლისა და გუანიდინის იზოთიოციანატისგან.გარდა ამისა, RNase ინჰიბიტორები, როგორც წესი, იმყოფებიან ლიზის ბუფერში, რათა უზრუნველყონ ხელუხლებელი ვირუსული რნმ-ის იზოლაცია.

ლიზისის ბუფერის დამატების შემდეგ, შერევის მილის მორევა პულსით და ინკუბაცია ოთახის ტემპერატურაზე.შემდეგ ვირუსი ლიზდება უაღრესად დენატურირების პირობებში, რომელიც უზრუნველყოფილია ლიზის ბუფერით.

ნიმუშის გაწმენდის შემდეგ, გამწმენდი პროცედურისთვის გამოიყენება ცენტრიფუგის მილი.ნიმუში ჩაიტვირთება ცენტრიფუგის მილში და შემდეგ ცენტრიფუგირდება.

ეს პროცედურა არის მყარი ფაზის მოპოვების მეთოდი, რომელშიც სტაციონარული ფაზა შედგება სილიკა გელის მატრიცისგან.

მარილისა და pH-ის ოპტიმალურ პირობებში, რნმ-ის მოლეკულები უკავშირდება სილიციუმის მემბრანას.

ამავდროულად, ცილა და სხვა დამაბინძურებლები ამოღებულია.

ცენტრიფუგაციის შემდეგ ჩადეთ ცენტრიფუგის მილი სუფთა შეგროვების მილში, გადააგდეთ ფილტრატი და შემდეგ დაამატეთ სარეცხი ბუფერი.

მილი კვლავ მოათავსეთ ცენტრიფუგაში, რათა სარეცხი ბუფერი აიძულოს მემბრანაში.ეს ამოიღებს ყველა დარჩენილ მინარევებს მემბრანიდან და ტოვებს მხოლოდ რნმ-ს დაკავშირებულს სილიკა გელთან.

ნიმუშის გარეცხვის შემდეგ, ჩადეთ მილი სუფთა მიკროცენტრიფუგის მილში და დაამატეთ გამორეცხვის ბუფერი.

შემდეგ იგი ცენტრიფუგირებულია, რათა გამორეცხვის ბუფერი აიძულოს მემბრანაში.გამორეცხვის ბუფერი შლის ვირუსულ რნმ-ს სპინის სვეტიდან და იღებს გასუფთავებულ რნმ-ს ცილების, ინჰიბიტორებისა და სხვა დამაბინძურებლებისგან თავისუფალი.

ნაბიჯი 2

შერეული კონცენტრატი

ვირუსული რნმ-ის ექსტრაქციის შემდეგ, შემდეგი ნაბიჯი არის რეაქციის ნარევის მომზადება PCR გაძლიერებისთვის.ამ ეტაპზე გამოიყენება კონცენტრატი.ეს კონცენტრირებული ხსნარი არის წინასწარ შერეული კონცენტრირებული ხსნარი, რომელიც შედგება პრემიქსის, საპირისპირო ტრანსკრიპტაზის, ნუკლეოტიდების, წინა პრაიმერის, საპირისპირო პრაიმერის, TaqMan ზონდისა და დნმ პოლიმერაზასგან.

საბოლოოდ, ამ რეაქციის ნარევის დასასრულებლად, ემატება რნმ-ის შაბლონი.მილები ურევენ პულსური მორევით, შემდეგ კი რეაქციის ნარევი იტვირთება PCR ფირფიტაში.PCR ფირფიტა ჩვეულებრივ შეიცავს 96 ჭაბურღილს და შეუძლია ერთდროულად რამდენიმე ნიმუშის ანალიზი.

ნაბიჯი 3

PCR გაძლიერება

შემდეგი, მოათავსეთ ფირფიტა PCR აპარატში, რომელიც არსებითად თერმოციკლერია.

რეალურ დროში RT-PCR გამოიყენება 2019 წლის ახალი კორონავირუსის გამოსავლენად RdrRP გენში, E გენში და N გენში სამიზნე თანმიმდევრობის გაძლიერებით.სამიზნე გენის არჩევანი დამოკიდებულია პრაიმერისა და ზონდის თანმიმდევრობაზე.

RT-PCR-ის პირველი ნაბიჯი არის საპირისპირო ტრანსკრიფცია.სინთეზირებულია დამატებითი დნმ-ის პირველი ჯაჭვი, რომელიც ინიცირებულია PCR საპირისპირო პრაიმერის მიერ, რომელიც აკავშირებს ვირუსული რნმ-ის გენომის დამატებით ნაწილს.შემდეგ საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა ამატებს დნმ ნუკლეოტიდებს პრაიმერის მე-3 ბოლოში ვირუსული რნმ-ის დამატებითი დნმ-ის სინთეზისთვის.ამ ეტაპის ტემპერატურა და ხანგრძლივობა დამოკიდებულია გამოყენებული პრაიმერებზე, სამიზნე რნმ-ზე და საპირისპირო ტრანსკრიპტაზაზე.

შემდეგი, გამოიყენება საწყისი დენატურაციის საფეხური, რაც იწვევს რნმ-დნმ ჰიბრიდის დენატურაციას.ეს ნაბიჯი აუცილებელია დნმ პოლიმერაზას გასააქტიურებლად.ამავდროულად, საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა ინაქტივირებულია.

PCR შედგება თერმული ციკლების სერიისგან.თითოეული ციკლი შედგება დენატურაციის, ანეილირების და გაფართოების საფეხურებისგან.

დენატურაციის საფეხური მოიცავს რეაქციის კამერის გაცხელებას 95 გრადუს ცელსიუსამდე და მის გამოყენებას ორჯაჭვიანი დნმ-ის შაბლონის დენატურაციისთვის.

შემდეგ ეტაპზე, რეაქციის ტემპერატურა მცირდება 58 გრადუსამდე ცელსიუსამდე, რაც საშუალებას აძლევს პრაიმერს შეაერთოს მისი ერთჯაჭვიანი დნმ-ის შაბლონის დამატებითი ნაწილი.დუღილის ტემპერატურა პირდაპირ დამოკიდებულია პრაიმერის სიგრძეზე და შემადგენლობაზე.

გაფართოების ეტაპზე, დნმ პოლიმერაზა ასინთეზებს დნმ-ის ახალ ჯაჭვს, რომელიც ავსებს დნმ-ის შაბლონის ჯაჭვს.შაბლონს დამატებითი ბირთვების დამატებით 5′-დან 3′-მდე რეაქციის ნარევიდან.ამ ეტაპის ტემპერატურა დამოკიდებულია გამოყენებული დნმ პოლიმერაზაზე.

პირველი ციკლის შემდეგ მიიღება ორჯაჭვიანი დნმ-ის სამიზნე.

შემდეგ შედით მეორე ციკლში.ორჯაჭვიანი დნმ დენატურირებულია ორი ერთჯაჭვიანი დნმ-ის მოლეკულის წარმოქმნით.

შემდეგ საფეხურზე რეაქციის ტემპერატურა ქვეითდება, პრაიმერები იკვრება თითოეულ ერთჯაჭვიან დნმ-ის შაბლონზე და Taq-man-ის ზონდი ანელდება სამიზნე დნმ-ის დამატებით ნაწილზე.

TaqMan ზონდი შედგება ფტორფორისგან, რომელიც კოვალენტურად არის დაკავშირებული ოლიგონუკლეოტიდის ზონდის 5' ბოლოსთან.ციკლერის სინათლის წყაროს აღგზნებისას, ფტორფორი ასხივებს ფლუორესცენციას.გარდა ამისა, ზონდი შედგება მე-3 ბოლოში ჩამქრალისაგან.რეპორტიორი გენის სიახლოვე ჩამქრალთან ხელს უშლის ფლუორესცენციის გამოვლენას.

გაფართოების ეტაპზე, დნმ პოლიმერაზა ასინთეზებს ახალ ძაფს.როდესაც პოლიმერაზა აღწევს TaqMan ზონდს, მისი ენდოგენური 5'ნუკლეაზას აქტივობა წყვეტს ზონდს, გამოყოფს საღებავს ჩამქრალისგან.

PCR-ის ყოველი ციკლით გამოიყოფა მეტი საღებავის მოლეკულა, რის შედეგადაც იზრდება ფლუორესცენციის ინტენსივობა სინთეზირებული ამპლიკონების რაოდენობის პროპორციულად.

ეს მეთოდი საშუალებას იძლევა შეფასდეს მოცემული თანმიმდევრობის რაოდენობა ნიმუშში.ორჯაჭვიანი დნმ-ის ფრაგმენტების რაოდენობა ყოველ ციკლში ორმაგდება.ამიტომ, PCR შეიძლება გამოყენებულ იქნას ძალიან მცირე ნიმუშების გასაანალიზებლად.

ფლუორესცენტური სიგნალის გაზომვისთვის, ვოლფრამის ჰალოგენის ნათურა, აგზნების ფილტრი, რეფლექტორი, ლინზა, ემისიის ფილტრი და დამუხტვის დაწყვილებული მოწყობილობა გამოიყენება CCD კამერა.

ნაბიჯი 4 გამოვლენა

ფლუორესცენტური სიგნალის გაზომვისთვის, ვოლფრამის ჰალოგენის ნათურა, აგზნების ფილტრი, რეფლექტორი, ლინზა, ემისიის ფილტრი და დამუხტვის დაწყვილებული მოწყობილობა გამოიყენება CCD კამერა.

ნათურის გაფილტრული შუქი აირეკლება რეფლექტორით, გადის კონდენსატორის ლინზაში და ორიენტირებულია თითოეული ხვრელის ცენტრში.შემდეგ ხვრელიდან გამოსხივებული ფლუორესცენცია აირეკლება სარკედან, გადის ემისიის ფილტრში და აღმოჩენილია CCD კამერით.თითოეულ PCR ციკლში, თვითაღგზნებული ფტორფორული შუქი შეიძლება გამოვლინდეს CCD-ით.

ის დაჭერილ შუქს ციფრულ მონაცემად გარდაქმნის.ამ მეთოდს უწოდებენ რეალურ დროში PCR და ის საშუალებას იძლევა რეალურ დროში მონიტორინგს PCR რეაქციის პროგრესი.