მიმოხილვა
ტრანსგენური მცენარეების სწრაფი იდენტიფიკაცია
ტექსტი/ტონგ იუჩენგი
ექსპერიმენტული ოპერაცია/ჰან იინგი
რედაქტორი/ვენ იუჯუნი
სიტყვები/1600+
კითხვის რეკომენდებული დრო/8-10 წუთი
ტრანსგენური მცენარეების სწრაფი იდენტიფიკაცია
როგორც ახალბედა ლაბორატორიაში, არ არის კარგი სამუშაო დადებითი მცენარეების გამოყოფა მცენარეთა თაიგულიდან დაბალი კონვერტაციის კოეფიციენტით.პირველ რიგში, დნმ უნდა იყოს ამოღებული დიდი რაოდენობით ნიმუშებიდან სათითაოდ, შემდეგ კი უცხო გენები გამოვლინდება PCR-ით.თუმცა, შედეგები ხშირად ცარიელი და ზოლებია, ზოგჯერ რამდენიმე ელემენტით, მაგრამ შეუძლებელია იმის დადგენა, არის თუ არა გამოტოვებული აღმოჩენები თუ ცრუ აღმოჩენები..ძალიან უმწეოა ასეთ ექსპერიმენტულ პროცესს და შედეგებს?არ ინერვიულოთ, ძმა გასწავლით როგორ გამოავლინოთ ტრანსგენური დადებითი მცენარეები მარტივად და ზუსტად.
Ნაბიჯი 1: დიზაინის გამოვლენის პრაიმერები
განსაზღვრეთ ენდოგენური გენი და ეგზოგენური გენი, რომელიც უნდა გამოვლინდეს შესამოწმებელი ნიმუშის მიხედვით, და შეარჩიეთ წარმომადგენლობითი 100-500bp თანმიმდევრობა გენში პრაიმერის დიზაინისთვის.კარგ პრაიმერებს შეუძლიათ უზრუნველყონ აღმოჩენის შედეგების სიზუსტე და შეამცირონ გამოვლენის დრო (იხილეთ დანართი საყოველთაოდ გამოყენებული გამოვლენის პრაიმერებისთვის).
Შენიშვნა:
ახლად შემუშავებულ პრაიმერებს სჭირდებათ რეაქციის პირობების ოპტიმიზაცია და დადასტურების სიზუსტე, სიზუსტე და გამოვლენის ზღვარი ფართომასშტაბიანი გამოვლენის განხორციელებამდე.
ნაბიჯი 2:ექსპერიმენტული პროტოკოლის შემუშავება
დადებითი კონტროლი: გამოიყენეთ გასუფთავებული დნმ, რომელიც შეიცავს სამიზნე ფრაგმენტს, როგორც შაბლონს, რათა დადგინდეს ნორმალურია თუ არა PCR რეაქციის სისტემა და პირობები.
უარყოფითი/ცარიელი კონტროლი: გამოიყენეთ დნმ-ის შაბლონი ან ddH2O, რომელიც არ შეიცავს სამიზნე ფრაგმენტს, როგორც შაბლონს, რათა აღმოაჩინოს არის თუ არა დაბინძურების წყარო PCR სისტემაში.
შიდა საცნობარო კონტროლი: გამოიყენეთ შესამოწმებელი ნიმუშის ენდოგენური გენის პრაიმერი/ზონდის კომბინაცია, რათა შეფასდეს, შესაძლებელია თუ არა შაბლონის აღმოჩენა PCR-ით.
Შენიშვნა:
დადებითი, უარყოფითი/ცარიელი კონტროლი და შიდა კონტროლის კონტროლი უნდა იყოს დაყენებული თითოეული ტესტისთვის ექსპერიმენტული შედეგების ვალიდურობის შესაფასებლად.
ნაბიჯი 3: ექსპერიმენტის მომზადება
გამოყენებამდე დააკვირდით არის თუ არა ხსნარი თანაბრად შერეული.ნალექის აღმოჩენის შემთხვევაში, გამოყენებამდე საჭიროა მისი გახსნა და შერევა ინსტრუქციის მიხედვით.გამოყენებამდე საჭიროა 2×PCR მიქსის პიპეტირება და მიკროპიპეტით შერევა, რათა თავიდან იქნას აცილებული იონის არათანაბარი განაწილება.
Შენიშვნა:
ამოიღეთ ინსტრუქციები და ყურადღებით წაიკითხეთ ისინი და მოამზადეთ ექსპერიმენტის დაწყებამდე ინსტრუქციების მკაცრი დაცვით.
ნაბიჯი 4: მოამზადეთ PCR რეაქციის სისტემა
ექსპერიმენტული პროტოკოლის მიხედვით შეურიეთ პრაიმერები, H2O, 2×PCR შეურიეთ, ცენტრიფუგა და გადაანაწილეთ ისინი თითოეულ სარეაქციო მილში.
Შენიშვნა:
ფართომასშტაბიანი ან გრძელვადიანი ტესტირებისთვის რეკომენდებულია PCR რეაქციის სისტემის გამოყენება, რომელიც შეიცავს UNG ფერმენტს, რომელიც ეფექტურად აარიდებს PCR პროდუქტებით გამოწვეული აეროზოლური დაბინძურებას.
ნაბიჯი 5: დაამატეთ რეაქციის შაბლონი
Direct PCR ტექნოლოგიის გამოყენებით, არ არის საჭირო ნუკლეინის მჟავას გამწმენდი დამღლელი პროცესი.ნიმუშის შაბლონი შეიძლება მომზადდეს 10 წუთში და დაემატოს შესაბამის PCR რეაქციის სისტემას.
Შენიშვნა:
Lysis მეთოდს აქვს უკეთესი გამოვლენის ეფექტი და მიღებული პროდუქტი შეიძლება გამოყენებულ იქნას მრავალჯერადი გამოვლენის რეაქციისთვის.
5.1: ფოთლების პირდაპირი PCR
სახელმძღვანელოში მოცემული სურათის ზომის მიხედვით დავჭრათ ფოთლის ქსოვილი 2-3მმ დიამეტრით და მოვათავსოთ PCR რეაქციის სისტემაში.
შენიშვნა: დარწმუნდით, რომ ფოთლის ფრაგმენტები მთლიანად ჩაეფლო PCR რეაქციის ხსნარში და არ დაამატოთ ფოთლის ზედმეტი ქსოვილი.
5.2: ფოთლის ლიზის მეთოდი
ფოთლის ქსოვილი დავჭრათ 5-7მმ დიამეტრით და მოვათავსოთ ცენტრიფუგის მილში.თუ აირჩევთ მწიფე ფოთლებს, გთხოვთ, მოერიდოთ ფოთლის ძირითადი ძარღვის ქსოვილების გამოყენებას.პიპეტით 50 მლ ბუფერი P1 ლიზატი ცენტრიფუგის მილში, რათა დარწმუნდეთ, რომ ლიზატს შეუძლია მთლიანად ჩაეფლოს ფოთლის ქსოვილი, მოათავსეთ იგი თერმოციკლერში ან ლითონის აბაზანაში და გაასუფთავეთ 95°C-ზე 5-10 წუთის განმავლობაში.
დაამატეთ 50 მლ ბუფერი P2 ნეიტრალიზაციის ხსნარი და კარგად აურიეთ.მიღებული ლიზატი შეიძლება გამოყენებულ იქნას შაბლონად და დაემატოს PCR რეაქციის სისტემას.
შენიშვნა: შაბლონის რაოდენობა უნდა იყოს PCR სისტემის 5-10%-ს შორის და არ უნდა აღემატებოდეს 20%-ს (მაგალითად, 20 μl PCR სისტემაში, დაამატეთ 1-2 μl ლიზის ბუფერი, არაუმეტეს 4 μl).
ნაბიჯი 6: PCR რეაქცია
PCR რეაქციის მილის ცენტრიფუგის შემდეგ, მოათავსეთ ისინი PCR ინსტრუმენტში ამპლიფიკაციისთვის.
Შენიშვნა:
რეაქციაში გამოიყენება არაგასუფთავებული შაბლონი ამპლიფიკაციისთვის, ამიტომ ამპლიფიკაციის ციკლების რაოდენობა 5-10 ციკლით მეტია, ვიდრე გასუფთავებული დნმ-ის შაბლონის გამოყენებისას.
ნაბიჯი 7: ელექტროფორეზის გამოვლენა და შედეგების ანალიზი
M:100bp დნმ კიბე
1\4: გასუფთავებული დნმ მეთოდი
2\5: პირდაპირი PCR მეთოდი
3\6: ცარიელი კონტროლი
Ხარისხის კონტროლი:
ექსპერიმენტში დაყენებული სხვადასხვა კონტროლის ტესტის შედეგები უნდა აკმაყოფილებდეს შემდეგ პირობებს.წინააღმდეგ შემთხვევაში, უნდა მოხდეს პრობლემის მიზეზის ანალიზი და პრობლემის აღმოფხვრის შემდეგ ტესტი კვლავ უნდა ჩატარდეს.
ცხრილი 1. სხვადასხვა საკონტროლო ჯგუფების ნორმალური ტესტის შედეგები
*როდესაც პლაზმიდი გამოიყენება როგორც დადებითი კონტროლი, ენდოგენური გენის ტესტის შედეგი შეიძლება იყოს უარყოფითი
შედეგის გადაწყვეტილება:
ა. ნიმუშის ენდოგენური გენის ტესტის შედეგი უარყოფითია, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ დნმ, რომელიც შესაფერისია ჩვეულებრივი PCR გამოვლენისთვის, არ შეიძლება ამოღებულ იქნეს ნიმუშიდან ან ამოღებული დნმ შეიცავს PCR რეაქციის ინჰიბიტორებს და დნმ ხელახლა უნდა იქნას ექსტრაქტი.
B. ნიმუშის ენდოგენური გენის ტესტის შედეგი დადებითია, ხოლო ეგზოგენური გენის ტესტის შედეგი უარყოფითია, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ ჩვეულებრივი PCR გამოვლენისთვის შესაფერისი დნმ ამოღებულია ნიმუშიდან და შეიძლება ვიმსჯელოთ, რომ XXX გენი არ არის გამოვლენილი ნიმუშში.
C. ნიმუშის ენდოგენური გენის ტესტის შედეგი დადებითია, ხოლო ეგზოგენური გენის ტესტის შედეგი დადებითია, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ ჩვეულებრივი PCR გამოვლენისთვის შესაფერისი დნმ ამოღებულია ნიმუშიდან და ნიმუში დნმ შეიცავს XXX გენს.დადასტურების ექსპერიმენტები შეიძლება ჩატარდეს შემდგომში.
ნაბიჯი 8: დიზაინის გამოვლენის პრაიმერები
ექსპერიმენტის შემდეგ გამოიყენეთ 2% ნატრიუმის ჰიპოქლორიტის ხსნარი და 70% ეთანოლის ხსნარი ექსპერიმენტის არეალის გასასუფთავებლად, გარემოს დაბინძურების თავიდან ასაცილებლად.
დანართი
ცხრილი 2. გენმოდიფიცირებული მცენარეების ზოგადი PCR-ის გამოვლენისთვის ხშირად გამოყენებული პრაიმერები
საცნობარო დოკუმენტი:
SN/T 1202-2010, ხარისხობრივი PCR გამოვლენის მეთოდი გენმოდიფიცირებული მცენარეული ინგრედიენტებისთვის საკვებში.
სოფლის მეურნეობის სამინისტროს განცხადება 1485-5-2010, გენმოდიფიცირებული მცენარეებისა და მათი პროდუქტების ინგრედიენტების ტესტირება - ბრინჯი M12 და მისი წარმოებულები.
გამოქვეყნების დრო: 09-09-2021
