როგორც ახალი ლაბორატორიაში, ეს არ არის კარგი სამუშაო დადებითი მცენარეების გარჩევა მცენარეთა თაიგულიდან დაბალი კონვერტაციის კოეფიციენტით.პირველ რიგში, დნმ უნდა იყოს ამოღებული დიდი რაოდენობით ნიმუშებიდან სათითაოდ, შემდეგ კი უცხო გენები გამოვლინდება PCR-ით.თუმცა, შედეგები ხშირად ცარიელი და ზოლებია, ზოგჯერ რამდენიმე ელემენტით, მაგრამ შეუძლებელია იმის დადგენა, არის თუ არა გამოტოვებული აღმოჩენები თუ ცრუ აღმოჩენები..ძალიან უმწეოა ასეთ ექსპერიმენტულ პროცესს და შედეგებს?არ ინერვიულოთ, ძმა გასწავლით როგორ გამოავლინოთ ტრანსგენური დადებითი მცენარეები მარტივად და ზუსტად.

Ნაბიჯი 1

დიზაინის გამოვლენის პრაიმერები

განსაზღვრეთ ენდოგენური გენი და ეგზოგენური გენი, რომელიც უნდა გამოვლინდეს შესამოწმებელი ნიმუშის მიხედვით, და შეარჩიეთ წარმომადგენლობითი 100-500bp თანმიმდევრობა გენში პრაიმერის დიზაინისთვის.კარგ პრაიმერებს შეუძლიათ უზრუნველყონ აღმოჩენის შედეგების სიზუსტე და შეამცირონ გამოვლენის დრო (იხილეთ დანართი საყოველთაოდ გამოყენებული გამოვლენის პრაიმერებისთვის).

შენიშვნა: ახლად შემუშავებულ პრაიმერებს სჭირდებათ რეაქციის პირობების ოპტიმიზაცია და დადასტურების სიზუსტე, სიზუსტე და გამოვლენის ზღვარი ფართომასშტაბიანი აღმოჩენამდე.

ნაბიჯი 2

ექსპერიმენტული პროტოკოლის დიზაინი

დადებითი კონტროლი: გამოიყენეთ გასუფთავებული დნმ, რომელიც შეიცავს სამიზნე ფრაგმენტს, როგორც შაბლონს, რათა დადგინდეს ნორმალურია თუ არა PCR რეაქციის სისტემა და პირობები.

უარყოფითი/ცარიელი კონტროლი: გამოიყენეთ დნმ-ის შაბლონი ან ddH2O, რომელიც არ შეიცავს სამიზნე ფრაგმენტს, როგორც შაბლონს, რათა დადგინდეს არის თუ არა დაბინძურების წყარო PCR სისტემაში.

შიდა საცნობარო კონტროლი: გამოიყენეთ შესამოწმებელი ნიმუშის ენდოგენური გენის პრაიმერი/ზონდის კომბინაცია, რათა შეფასდეს, შესაძლებელია თუ არა შაბლონის აღმოჩენა PCR-ით.

შენიშვნა:

დადებითი, უარყოფითი/ცარიელი კონტროლი და შიდა კონტროლის კონტროლი უნდა იყოს დაყენებული თითოეული ტესტისთვის ექსპერიმენტული შედეგების ვალიდურობის შესაფასებლად.

ექსპერიმენტის მომზადება

გამოყენებამდე დააკვირდით არის თუ არა ხსნარი თანაბრად შერეული.ნალექის აღმოჩენის შემთხვევაში, გამოყენებამდე საჭიროა მისი გახსნა და შერევა ინსტრუქციის მიხედვით.გამოყენებამდე საჭიროა 2×PCR მიქსის პიპეტირება და მიკროპიპეტით შერევა, რათა თავიდან იქნას აცილებული იონის არათანაბარი განაწილება.

შენიშვნა:

ამოიღეთ სახელმძღვანელო და ყურადღებით წაიკითხეთ იგი და მოამზადეთ ექსპერიმენტის დაწყებამდე სახელმძღვანელოს მოთხოვნების მკაცრად დაცვით.

ნაბიჯი 4

მოამზადეთ PCR რეაქციის სისტემა

ექსპერიმენტული პროტოკოლის მიხედვით, აურიეთ პრაიმერები, H2O და 2×PCR თანაბრად, ცენტრიფუგა და გადაანაწილეთ ისინი თითოეულ რეაქციის მილში.

შენიშვნა:

ფართომასშტაბიანი ან გრძელვადიანი ტესტირებისთვის რეკომენდებულია PCR რეაქციის სისტემის გამოყენება, რომელიც შეიცავს UNG ფერმენტს, რომელიც ეფექტურად აარიდებს PCR პროდუქტებით გამოწვეული აეროზოლური დაბინძურებას.

ნაბიჯი 5

დაამატეთ რეაქციის შაბლონი

პირდაპირი PCR ტექნოლოგიის გამოყენებით, არ არის საჭირო ნუკლეინის მჟავას დამღლელი გაწმენდის პროცესი, ნიმუშის შაბლონი შეიძლება მომზადდეს 10 წუთში და შეიძლება დაემატოს შესაბამისი PCR რეაქციის სისტემა.

შენიშვნა:

დაშლის მეთოდს აქვს უკეთესი გამოვლენის ეფექტი და მიღებული პროდუქტი შეიძლება გამოყენებულ იქნას მრავალჯერადი გამოვლენის რეაქციისთვის.

5.1: ფოთლების პირდაპირი გაფართოება

სახელმძღვანელოში მოცემული სურათის ზომის მიხედვით დავჭრათ ფოთლის ქსოვილი 2-3მმ დიამეტრით და მოვათავსოთ PCR რეაქციის სისტემაში.

შენიშვნა: დარწმუნდით, რომ ფოთლის ფრაგმენტები მთლიანად ჩაეფლო PCR რეაქციის ხსნარში და არ დაამატოთ ფოთლის ზედმეტი ქსოვილი.

5.2: ფოთლის გაყოფის მეთოდი

ფოთლის ქსოვილი დავჭრათ 5-7მმ დიამეტრით და მოვათავსოთ ცენტრიფუგის მილში.თუ აირჩევთ მწიფე ფოთლებს, გთხოვთ, მოერიდოთ ფოთლის ძირითადი ძარღვის ქსოვილების გამოყენებას.პიპეტით 50 მლ ბუფერი P1 ლიზატი ცენტრიფუგის მილში, რათა დარწმუნდეთ, რომ ლიზატს შეუძლია მთლიანად ჩაეფლოს ფოთლის ქსოვილი, მოათავსეთ იგი თერმოციკლერში ან ლითონის აბაზანაში და გაასუფთავეთ 95°C-ზე 5-10 წუთის განმავლობაში.

დაამატეთ 50 მლ ბუფერი P2 ნეიტრალიზაციის ხსნარი და კარგად აურიეთ.მიღებული ლიზატი შეიძლება გამოყენებულ იქნას შაბლონად და დაემატოს PCR რეაქციის სისტემას.

შენიშვნა: შაბლონის რაოდენობა არის PCR სისტემის 5-10%-ს შორის და არ უნდა აღემატებოდეს 20%-ს (მაგალითად, 20 μl PCR სისტემაში დაამატეთ 1-2 μl ლიზისური ხსნარი, არაუმეტეს 4 μl).

ნაბიჯი 6

PCR რეაქცია

PCR რეაქციის მილის ცენტრიფუგის შემდეგ, იგი მოთავსებულია PCR ინსტრუმენტში ამპლიფიკაციისთვის.

შენიშვნა:

რეაქციაში გამოიყენება არაგასუფთავებული შაბლონი ამპლიფიკაციისთვის, ამიტომ ამპლიფიკაციის ციკლების რაოდენობა 5-10 ციკლით მეტია, ვიდრე გასუფთავებული დნმ-ის შაბლონის გამოყენებისას.

ნაბიჯი 7

ელექტროფორეზის გამოვლენა და შედეგების ანალიზი

M: 100bp დნმ-ის კიბე

1\4: გასუფთავებული დნმ მეთოდი

2\5: პირდაპირი PCR მეთოდი

3\6: ცარიელი კონტროლი

QC:

ექსპერიმენტში დაყენებული სხვადასხვა კონტროლის ტესტის შედეგები უნდა აკმაყოფილებდეს შემდეგ პირობებს.წინააღმდეგ შემთხვევაში, უნდა მოხდეს პრობლემის მიზეზის ანალიზი და პრობლემის აღმოფხვრის შემდეგ ტესტი კვლავ უნდა ჩატარდეს.

ცხრილი 1. სხვადასხვა საკონტროლო ჯგუფების ნორმალური ტესტის შედეგები

*როდესაც პლაზმიდი გამოიყენება როგორც დადებითი კონტროლი, ენდოგენური გენის ტესტის შედეგი შეიძლება იყოს უარყოფითი

შედეგის გადაწყვეტილება:

ა. ნიმუშის ენდოგენური გენის ტესტის შედეგი უარყოფითია, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ დნმ, რომელიც შესაფერისია ჩვეულებრივი PCR გამოვლენისთვის, არ შეიძლება ამოღებულ იქნეს ნიმუშიდან ან ამოღებული დნმ შეიცავს PCR რეაქციის ინჰიბიტორებს და დნმ ხელახლა უნდა იქნას ექსტრაქტი.

B. ნიმუშის ენდოგენური გენის ტესტის შედეგი დადებითია, ხოლო ეგზოგენური გენის ტესტის შედეგი უარყოფითია, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ ჩვეულებრივი PCR გამოვლენისთვის შესაფერისი დნმ ამოღებულია ნიმუშიდან და შეიძლება ვიმსჯელოთ, რომ XXX გენი არ არის გამოვლენილი ნიმუშში.

C. ნიმუშის ენდოგენური გენის ტესტის შედეგი დადებითია, ხოლო ეგზოგენური გენის ტესტის შედეგი დადებითია, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ ჩვეულებრივი PCR გამოვლენისთვის შესაფერისი დნმ ამოღებულია ნიმუშიდან და ნიმუში დნმ შეიცავს XXX გენს.დადასტურების ექსპერიმენტები შეიძლება ჩატარდეს შემდგომში.

ნაბიჯი 8

დიზაინის გამოვლენის პრაიმერები

ექსპერიმენტის შემდეგ გამოიყენეთ 2% ნატრიუმის ჰიპოქლორიტის ხსნარი და 70% ეთანოლის ხსნარი ექსპერიმენტის არეალის გასასუფთავებლად, გარემოს დაბინძურების თავიდან ასაცილებლად.