ტრადიციული საპირისპირო ტრანსკრიპტაზები ვერ იტანენ მაღალ ტემპერატურას (MMLV აქტივობის ოპტიმალური ტემპერატურაა 37-50°C, ხოლო AMV 42-60°C).უფრო რთული ვირუსული რნმ არ შეიძლება ეფექტურად გადაიწეროს cDNA-ში დაბალ ტემპერატურაზე, რაც იწვევს გამოვლენის ეფექტურობის შემცირებას.ტრადიციული RT-qPCR ზოგადად მოითხოვს ორი ძირითადი ფერმენტის (საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა და დნმ პოლიმერაზა) მონაწილეობას, რაც შეუძლებელს ხდის რეაქციის სისტემის მუშაობის გამარტივებას და ღირებულების შემცირებას.აქ წარმოგიდგენთ ორ მაღალტემპერატურულ რეზისტენტულ საპირისპირო ტრანსკრიპტაზას, TtH და RevTaq.ამ ორ ფერმენტს ასევე აქვს დნმ პოლიმერაზას ფუნქცია, ამიტომ მათ ორფუნქციურ ფერმენტებს უწოდებენ.

TtH დნმ პოლიმერაზა

ალბათ გსმენიათ TtH-ის შესახებ, რომელიც მიღებულია თერმოფილური ბაქტერიისგან Thermus thermophilus HB8.ორვალენტიანი კათიონების არსებობისას, როგორიცაა Mg2+, მას აქვს დნმ პოლიმერაზას აქტივობა.იგი ფართოდ გამოიყენება PCR რეაქციებში, როგორიცაა Taq ფერმენტი, მაგრამ მას აქვს უფრო მაღალი სითბოს წინააღმდეგობა, ვიდრე Taq ფერმენტი, ამიტომ მას ასევე აქვს უკეთესი ეფექტი PCR-ზე მაღალი GC შემცველობის შაბლონებით.

· ამ ფერმენტს ძირითადად არ აქვს 3'→5' ეგზონუკლეაზური აქტივობა და 5'→3' ეგზონუკლეაზური აქტივობა, ამიტომ ის ასევე შეიძლება გამოყენებულ იქნას დიდოქსი თანმიმდევრობისთვის.

· ამ ფერმენტს აქვს RTase აქტივობა.Mn2+-ის თანდასწრებით, RTase აქტივობა გაძლიერდება.ამ ფუნქციის გამოყენებით, ის შეიძლება გამოყენებულ იქნას საპირისპირო ტრანსკრიფციის რეაქციისა და PCR რეაქციის შესასრულებლად იმავე მილში, ანუ ერთსაფეხურიანი RT-PCR.თუმცა, Mn2+-ის თანდასწრებით, RT-PCR-ის სიზუსტე არ არის მაღალი.RT აქტივობას არაფერი აქვს საერთო რნააზა H აქტივობასთან.

· Tth-DNA პოლიმერაზას გაზრდილი აქტივობა (pH9, ოპტიმალური +55℃~70℃, მაქსიმალური +95℃) გადალახავს რნმ-ის მეორადი სტრუქტურით გამოწვეულ პრობლემებს.მიღებული cDNA შეიძლება გაძლიერდეს PCR-ით იმავე ფერმენტით Mg2+ იონების თანდასწრებით.

· Tth-დნმ პოლიმერაზას უნარი შეასრულოს საპირისპირო ტრანსკრიფცია და დნმ-ის გაძლიერება მაღალ ტემპერატურაზე ამ ფერმენტს გამოსადეგს ხდის უჯრედული და ვირუსული რნმ-ის რაოდენობრივი RT-PCR, კლონირებისა და გენის ექსპრესიის ანალიზისთვის.
· Tth-დნმ პოლიმერაზა გამოიყენება RT-PCR-სთვის რნმ-ის 1კბ-მდე გასაძლიერებლად.

მახასიათებლები და უპირატესობები

Tth დნმ პოლიმერაზა:

• დარწმუნდით, რომ პროდუქტის ოპტიმიზირებულია პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის (PCR) ზომა, მინიმუმ 1000 bp RT-PCR რეაქციაში

• სუბსტრატად მიიღეთ მოდიფიცირებული დეზოქსირიბონუკლეოზიდის ტრიფოსფატი

• არ არის დაკავშირებული RNase H აქტივობასთან

• აქვს მაღალი თერმული სტაბილურობა პრობლემების დასაძლევად, ჩვეულებრივ დაკავშირებულია რნმ-ში არსებულ მაღალ მეორად სტრუქტურასთან

RevTaq RT-PCR დნმ პოლიმერაზა

სითბოს მდგრადი დნმ პოლიმერაზა შებრუნებული ტრანსკრიპტაზას აქტივობით

RevTaq-RT-PCR-DNA პოლიმერაზა არის ინჟინერირებული, მაღალ სითბოს მდგრადი, ორმაგი ფუნქციური ფერმენტი საპირისპირო ტრანსკრიპტაზასა და დნმ პოლიმერაზას აქტივობით, რომელიც მიღებულია მიმართული და ხელოვნური ევოლუციით.

· RevTaq RT-PCR დნმ პოლიმერაზას ნახევარგამოყოფის პერიოდი 95°C-ზე 40 წუთზე მეტია.

· RevTaq RT-PCR დნმ პოლიმერაზა საშუალებას იძლევა მაღალი ტემპერატურის საპირისპირო ტრანსკრიფცია პირდაპირ რნმ-ის შაბლონიდან და საპირისპირო ტრანსკრიფციის ნაბიჯი შეიძლება მრავალჯერ განმეორდეს მეტი cDNA შაბლონის გენერირებისთვის.

· RevTaq RT-PCR დნმ პოლიმერაზა საშუალებას იძლევა "ნულოვანი საფეხური" RT-PCR (არ არის იზოთერმული საპირისპირო ტრანსკრიფციის საფეხური), რადგან ციკლური PCR გაფართოების საფეხურზე, საპირისპირო ტრანსკრიფცია და დნმ-ის გაძლიერება ერთდროულად ხდება.ეს ასევე ხელს უწყობს საპირისპირო ტრანსკრიფციის რეაქციას მაღალ ტემპერატურაზე, რითაც ამცირებს პრობლემებს, რომლებიც წარმოიქმნება რნმ-ის ძლიერი მეორადი სტრუქტურის დნობისას მაღალ ტემპერატურაზე.

· აპტამერზე დაფუძნებული ცხელი დაწყების ფორმულის გამო, RevTaq RT-PCR დნმ პოლიმერაზა გამოიმუშავებს უკეთეს შედეგს, როდესაც ანეილის და გაფართოების ტემპერატურა 57°C-ზე მაღალია.

· ვინაიდან ფერმენტი სითბოს მდგრადია, რეკომენდებულია პრაიმერებისა და ზონდების დაპროექტება ძალიან მაღალი დნობის წერტილებით (>60°C).

· რეაქციის დაყენების პროცესში რეკომენდირებულია დამუშავების/გაფართოების საფეხურის ტემპერატურის ოპტიმიზაცია ტემპერატურის გრადიენტის მეშვეობით.

· რაც უფრო მაღალია ტემპერატურა, მით უფრო მაღალია PCR-ის სპეციფიკა.საპირისპირო ტრანსკრიფციის ციკლი ჩვეულებრივ ტარდება უფრო მაღალ ტემპერატურაზე, ვიდრე PCR ციკლი, რადგან დნმ პრაიმერი:რნმ შაბლონის ჰიბრიდიზაციას ჩვეულებრივ აქვს უფრო მაღალი დნობის წერტილი, ვიდრე დნმ პრაიმერი:cDNA შაბლონის დუპლექსი.

· RevTaq RT-PCR დნმ პოლიმერაზა გენეტიკურად ინჟინერირებული და ოპტიმიზირებულია და ამპლიკონის ზომა არის 60-300 bp შორის.

RevTaq RT-PCR დნმ პოლიმერაზას გამოვლენის ლიმიტი აღწევს 4 ეგზემპლარს/

ოპტიმიზებული რეაქციის სისტემა (მაღალი დნობის წერტილის პრაიმერების დაყენება) ნაჩვენებია სურათზე.RevTaq RT-PCR დნმ პოლიმერაზაზე ორიენტირებული RT-PCR აჩვენებს უკეთეს მგრძნობელობას, ვიდრე TaqPath 1-საფეხურიანი RT-qPCR მასტერ ნაზავი და უფრო დაბალი აღმოჩენის ნიმუშის განზავების გრადიენტი.

მეტი უპირატესობები:

სწრაფი დაწყების ფუნქცია → საწყისი თერმული დენატურაციის ეტაპის გამოტოვება შესაძლებელია.

ცხელი დაწყების აპტამერის ფორმულა → დაუყოვნებლივ უზრუნველყოს ფერმენტის 100% აქტივობა და თავიდან აიცილოს არასპეციფიკური გაძლიერება დაბალ ტემპერატურაზე (<57°C).

დაშლის ფუნქცია → რნმ-ის ექსტრაქციის საფეხური გამოტოვებულია, რადგან RevTaq RT-PCR დნმ პოლიმერაზას ასევე შეუძლია ნედლი რეაქციის ნიმუშების დამუშავება.მას შეუძლია დაუყოვნებლივ გაანადგუროს ევკარიოტების, ბაქტერიების და ვირუსების უჯრედული მემბრანები ცხელ RT-PCR ციკლში.

IVD ნედლეულის დონე → მაღალი ხარისხის სტანდარტები და უკიდურესად კონკურენტუნარიანი ფასები