არ არის გამაძლიერებელი სიგნალები

1. ნაკრებში შემავალი Taq დნმ პოლიმერაზა კარგავს თავის აქტივობას არასათანადო შენახვის ან ნაკრების ვადის გასვლის გამო.
რეკომენდაცია: დაადასტურეთ ნაკრების შენახვის პირობები;ხელახლა დაამატეთ Taq დნმ პოლიმერაზას შესაბამისი რაოდენობა PCR სისტემაში ან შეიძინეთ ახალი Real Time PCR ნაკრები შესაბამისი ექსპერიმენტებისთვის.

2. დნმ-ის შაბლონში ბევრია Taq დნმ პოლიმერაზას ინჰიბიტორი.
შემოთავაზება: გაასუფთავეთ შაბლონი ან შეამცირეთ გამოყენებული შაბლონის რაოდენობა.

3. Mg2+ კონცენტრაცია არ არის შესაფერისი.
რეკომენდაცია: ჩვენ მიერ მოწოდებული 2× რეალური PCR ნარევის Mg2+ კონცენტრაცია არის 3.5 მმ.თუმცა, ზოგიერთი სპეციალური პრაიმერისა და შაბლონისთვის, Mg2+ კონცენტრაცია შეიძლება იყოს უფრო მაღალი.ამიტომ, შეგიძლიათ პირდაპირ დაამატოთ MgCl2 Mg2+ კონცენტრაციის ოპტიმიზაციისთვის.ოპტიმიზაციისთვის რეკომენდებულია Mg2+ 0,5 მმ-ის გაზრდა ყოველ ჯერზე.

4. PCR გაძლიერების პირობები არ არის შესაფერისი და პრაიმერის თანმიმდევრობა ან კონცენტრაცია არასწორია.
წინადადება: დაადასტურეთ პრაიმერის თანმიმდევრობის სისწორე და პრაიმერი არ არის დეგრადირებული;თუ გამაძლიერებელი სიგნალი არ არის კარგი, შეეცადეთ შეამციროთ ანეილის ტემპერატურა და დაარეგულიროთ პრაიმერის კონცენტრაცია სათანადოდ.

5. შაბლონის რაოდენობა ძალიან ცოტაა ან ძალიან ბევრი.
რეკომენდაცია: შეასრულეთ შაბლონის ხაზოვანი გრადიენტური განზავება და შეარჩიეთ შაბლონის კონცენტრაცია საუკეთესო PCR ეფექტით რეალურ დროში PCR ექსპერიმენტისთვის.

NTC აქვს ძალიან მაღალი ფლუორესცენციის მნიშვნელობა

1.რეაგენტებით დაბინძურება გამოწვეული ექსპლუატაციის დროს.
რეკომენდაცია: ჩაანაცვლეთ ახალი რეაგენტებით რეალურ დროში PCR ექსპერიმენტებისთვის.

2. დაბინძურება მოხდა PCR რეაქციის სისტემის მომზადების დროს.
რეკომენდაცია: ექსპლუატაციის დროს მიიღეთ აუცილებელი დამცავი ზომები, როგორიცაა: ლატექსის ხელთათმანების ტარება, პიპეტის წვერის გამოყენება ფილტრით და ა.შ.

3. პრაიმერები დეგრადირებულია და პრაიმერების დეგრადაცია გამოიწვევს არასპეციფიკურ გაძლიერებას.
წინადადება: გამოიყენეთ SDS-PAGE ელექტროფორეზი იმის დასადგენად, არის თუ არა პრაიმერები დეგრადირებული და შეცვალეთ ისინი ახალი პრაიმერებით რეალურ დროში PCR ექსპერიმენტებისთვის.

პრაიმერის დიმერი ან არასპეციფიკური გაძლიერება

1. Mg2+ კონცენტრაცია არ არის შესაფერისი.
რეკომენდაცია: ჩვენ მიერ მოწოდებული 2× Real PCR EasyTM Mix-ის Mg2+ კონცენტრაცია არის 3,5 მმ.თუმცა, ზოგიერთი სპეციალური პრაიმერისა და შაბლონისთვის, Mg2+ კონცენტრაცია შეიძლება იყოს უფრო მაღალი.ამიტომ, შეგიძლიათ პირდაპირ დაამატოთ MgCl2 Mg2+ კონცენტრაციის ოპტიმიზაციისთვის.ოპტიმიზაციისთვის რეკომენდებულია Mg2+ 0,5 მმ-ის გაზრდა ყოველ ჯერზე.

2. PCR ანეილირების ტემპერატურა ძალიან დაბალია.
შემოთავაზება: ყოველ ჯერზე გაზარდეთ PCR ანეილირების ტემპერატურა 1℃ ან 2℃-ით.

3. PCR პროდუქტი ძალიან გრძელია.
რეკომენდაცია: რეალურ დროში PCR პროდუქტის სიგრძე უნდა იყოს 100-150bp, არაუმეტეს 500bp.

4. პრაიმერები დეგრადირებულია და პრაიმერების დეგრადაცია გამოიწვევს სპეციფიკური ამპლიფიკაციის გამოჩენას.
წინადადება: გამოიყენეთ SDS-PAGE ელექტროფორეზი იმის დასადგენად, არის თუ არა პრაიმერები დეგრადირებული და შეცვალეთ ისინი ახალი პრაიმერებით რეალურ დროში PCR ექსპერიმენტებისთვის.

5. PCR სისტემა არასწორია, ან სისტემა ძალიან მცირეა.
წინადადება: PCR რეაქციის სისტემა ძალიან მცირეა, რაც გამოიწვევს აღმოჩენის სიზუსტის შემცირებას.უმჯობესია გამოიყენოთ რაოდენობრივი PCR ინსტრუმენტის მიერ რეკომენდებული რეაქციის სისტემა რეალურ დროში PCR ექსპერიმენტის ხელახლა გასატარებლად.

რაოდენობრივი მნიშვნელობების ცუდი განმეორებადობა

1. ინსტრუმენტი გაუმართავია.
შემოთავაზება: შეიძლება იყოს შეცდომები ხელსაწყოს თითოეულ PCR ხვრელს შორის, რაც გამოიწვევს ცუდი გამეორებას ტემპერატურის მართვის ან გამოვლენის დროს.გთხოვთ, შეამოწმოთ შესაბამისი ინსტრუმენტის ინსტრუქციის მიხედვით.

2. ნიმუშის სისუფთავე არ არის კარგი.
რეკომენდაცია: უწმინდური ნიმუშები გამოიწვევს ექსპერიმენტის ცუდ განმეორებადობას, რაც მოიცავს შაბლონისა და პრაიმერების სისუფთავეს.უმჯობესია შაბლონის ხელახალი გაწმენდა, ხოლო პრაიმერები საუკეთესოდ გაწმენდილია SDS-PAGE-ით.

3. PCR სისტემის მომზადებისა და შენახვის დრო ძალიან დიდია.
შემოთავაზება: გამოიყენეთ რეალურ დროში PCR სისტემა PCR ექსპერიმენტისთვის მომზადებისთანავე და არ დატოვოთ იგი ძალიან დიდხანს.

4. PCR გაძლიერების პირობები არ არის შესაფერისი და პრაიმერის თანმიმდევრობა ან კონცენტრაცია არასწორია.
წინადადება: დაადასტურეთ პრაიმერის თანმიმდევრობის სისწორე და პრაიმერი არ არის დეგრადირებული;თუ გამაძლიერებელი სიგნალი არ არის კარგი, შეეცადეთ შეამციროთ ანეილის ტემპერატურა და დაარეგულიროთ პრაიმერის კონცენტრაცია სათანადოდ.

5. PCR სისტემა არასწორია, ან სისტემა ძალიან მცირეა.
წინადადება: PCR რეაქციის სისტემა ძალიან მცირეა, რაც გამოიწვევს აღმოჩენის სიზუსტის შემცირებას.უმჯობესია გამოიყენოთ რაოდენობრივი PCR ინსტრუმენტის მიერ რეკომენდებული რეაქციის სისტემა რეალურ დროში PCR ექსპერიმენტის ხელახლა გასატარებლად.