• PCR არის მეთოდი, რომელიც გამოიყენება დნმ-ის გასაძლიერებლად მცირე რაოდენობით დნმ-ის შაბლონიდან.RT-PCR იყენებს საპირისპირო ტრანსკრიფციას რნმ-ის წყაროდან დნმ-ის შაბლონის შესაქმნელად, რომელიც შემდეგ შეიძლება გაძლიერდეს.
• PCR და RT-PCR, როგორც წესი, საბოლოო წერტილის რეაქციებია, ხოლო qPCR და RT-qPCR იყენებენ პროდუქტის სინთეზის სიჩქარის კინეტიკას PCR რეაქციის დროს, რათა დაადგინონ არსებული შაბლონის რაოდენობა.
• უფრო ახალი მეთოდები, როგორიცაა ციფრული PCR, უზრუნველყოფს დნმ-ის საწყისი შაბლონის აბსოლუტურ რაოდენობრივ შეფასებას, ხოლო ისეთი მეთოდები, როგორიცაა იზოთერმული PCR, ამცირებს ძვირადღირებული აღჭურვილობის საჭიროებას საიმედო შედეგების უზრუნველსაყოფად.

პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია (PCR) არის შედარებით მარტივი და ფართოდ გამოყენებული მოლეკულური ბიოლოგიის ტექნიკა დნმ-ისა და რნმ-ის თანმიმდევრობების გასაძლიერებლად და გამოსავლენად.დნმ-ის კლონირებისა და ამპლიფიკაციის ტრადიციულ მეთოდებთან შედარებით, რასაც ხშირად დღეები სჭირდება, PCR-ს მხოლოდ რამდენიმე საათი სჭირდება.PCR ძალიან მგრძნობიარეა და მოითხოვს მინიმალურ შაბლონს კონკრეტული თანმიმდევრობის აღმოსაჩენად და გაძლიერებისთვის.ძირითადი PCR მეთოდები უფრო წინ წავიდა მარტივი დნმ-ისა და რნმ-ის გამოვლენიდან.ქვემოთ, ჩვენ მივაწოდეთ მიმოხილვა სხვადასხვა PCR მეთოდებისა და რეაგენტების შესახებ, რომლებსაც ჩვენ გთავაზობთ Enzo Life Sciences-ში თქვენი კვლევის საჭიროებისთვის.ჩვენი მიზანია დავეხმაროთ მეცნიერებს სწრაფად მიიღონ PCR რეაგენტები, რათა გამოიყენონ მათ მომდევნო კვლევით პროექტში!

PCR

სტანდარტული PCR-სთვის საჭიროა მხოლოდ დნმ-პოლიმერაზა, მაგნიუმი, ნუკლეოტიდები, პრაიმერები, გასაძლიერებელი დნმ-ის შაბლონი და თერმოციკლერი.PCR მექანიზმი ისეთივე მარტივია, როგორც მისი დანიშნულება: 1) ორჯაჭვიანი დნმ (dsDNA) არის სითბოს დენატურაცია, 2) პრაიმერები შეესაბამება დნმ-ის ცალკეულ ჯაჭვებს და 3) პრაიმერები გაფართოვდებიან დნმ პოლიმერაზას მიერ, რის შედეგადაც წარმოიქმნება დნმ-ის ორი ასლი. ორიგინალური დნმ-ის ჯაჭვი.დენატურაციის, ანეილირების და დრეკადობის პროცესი ტემპერატურისა და დროების სერიაზე ცნობილია, როგორც გაძლიერების ერთი ციკლი (ნახ. 1).

ციკლის ყოველი ნაბიჯი უნდა იყოს ოპტიმიზირებული გამოყენებული შაბლონისა და პრაიმერის ნაკრებისთვის.ეს ციკლი მეორდება დაახლოებით 20-40-ჯერ და შემდეგ გაძლიერებული პროდუქტი შეიძლება გაანალიზდეს, როგორც წესი, აგაროზის გელით (ნახ. 2).

ვინაიდან PCR არის ძალიან მგრძნობიარე მეთოდი და ძალიან მცირე მოცულობებია საჭირო ერთჯერადი რეაქციისთვის, რეკომენდებულია მასტერ მიქსის მომზადება რამდენიმე რეაქციისთვის.ძირითადი ნაზავი კარგად უნდა იყოს შერეული და შემდეგ გაიყოს რეაქციების რაოდენობის მიხედვით, რათა უზრუნველყოფილი იყოს, რომ თითოეული რეაქცია შეიცავდეს ფერმენტების, dNTP-ების და პრაიმერების იგივე რაოდენობას.ბევრი მომწოდებელი, როგორიცაა Enzo Life Sciences, ასევე გვთავაზობს PCR მიქსებს, რომლებიც უკვე შეიცავს ყველაფერს, გარდა პრაიმერებისა და დნმ-ის შაბლონისა.

გუანინით/ციტოზინით მდიდარი (GC-მდიდარი) რეგიონები წარმოადგენს გამოწვევას სტანდარტული PCR ტექნიკაში.GC-ით მდიდარი თანმიმდევრობები უფრო სტაბილურია, ვიდრე GC დაბალი შემცველობის თანმიმდევრობები.გარდა ამისა, GC-ით მდიდარი თანმიმდევრობები ქმნიან მეორად სტრუქტურებს, როგორიცაა თმის სამაგრი მარყუჟები.შედეგად, GC-ით მდიდარი ორმაგი ძაფები ძნელია მთლიანად განცალკევდეს დენატურაციის ფაზაში.შესაბამისად, დნმ პოლიმერაზას არ შეუძლია შეუფერხებლად მოახდინოს ახალი ჯაჭვის სინთეზი.დენატურაციის უფრო მაღალმა ტემპერატურამ შეიძლება გააუმჯობესოს ეს, ხოლო დამუშავების უფრო მაღალი ტემპერატურისა და შედუღების ხანმოკლე დროის კორექტირებას შეუძლია თავიდან აიცილოს GC-ით მდიდარი პრაიმერების არასპეციფიკური შეკვრა.დამატებით რეაგენტებს შეუძლიათ გააძლიერონ GC-ით მდიდარი თანმიმდევრობების გაძლიერება.DMSO, გლიცეროლი და ბეტაინი ხელს უწყობს მეორადი სტრუქტურების დარღვევას, რომლებიც გამოწვეულია GC ურთიერთქმედებით და ამით ხელს უწყობს ორმაგი ძაფების გამოყოფას.

ცხელი დაწყება PCR

არასპეციფიკური გაძლიერება არის პრობლემა, რომელიც შეიძლება წარმოიშვას PCR-ის დროს.დნმ-პოლიმერაზების უმეტესობა, რომლებიც გამოიყენება PCR-სთვის, საუკეთესოდ მუშაობს 68°C-დან 72°C-მდე ტემპერატურაზე.ფერმენტი ასევე შეიძლება იყოს აქტიური დაბალ ტემპერატურაზე, თუმცა უფრო დაბალი ხარისხით.დუღილის ტემპერატურაზე ბევრად დაბალ ტემპერატურაზე, პრაიმერებს შეუძლიათ არასპეციფიკურად შეკვრა და გამოიწვიოს არასპეციფიკური გაძლიერება, მაშინაც კი, თუ რეაქცია ყინულზეა მოწყობილი.ამის თავიდან აცილება შესაძლებელია პოლიმერაზას ინჰიბიტორების გამოყენებით, რომლებიც დნმ-პოლიმერაზასგან დისოცირდებიან მხოლოდ გარკვეული ტემპერატურის მიღწევის შემდეგ, აქედან გამომდინარეობს ტერმინი ცხელი დაწყების PCR.ინჰიბიტორი შეიძლება იყოს ანტისხეული, რომელიც აკავშირებს პოლიმერაზას და დენატურდება დენატურაციის საწყის ტემპერატურაზე (ჩვეულებრივ 95°C).

მაღალი სიზუსტის პოლიმერაზა

მიუხედავად იმისა, რომ დნმ პოლიმერაზები საკმაოდ ზუსტად ძლიერდება შაბლონის თავდაპირველ თანმიმდევრობაზე, შეიძლება მოხდეს შეცდომები ნუკლეოტიდებთან შესაბამისობაში.აპლიკაციების შეუსაბამობამ, როგორიცაა კლონირება, შეიძლება გამოიწვიოს შეკვეცილი ტრანსკრიპტები და არასწორად თარგმნილი ან არააქტიური ცილები ქვემოთ.ამ შეუსაბამობების თავიდან აცილების მიზნით, პოლიმერაზები „კორექტირების“ აქტივობით იქნა გამოვლენილი და ჩართული სამუშაო პროცესში.პირველი კორექტორი პოლიმერაზა, Pfu, გამოვლინდა 1991 წელს Pyrococcus furiosus-ში.ამ Pfu ფერმენტს აქვს 3'-დან 5'-მდე ეგზონუკლეაზური აქტივობა.დნმ-ის გაძლიერებისას, ეგზონუკლეაზა შლის შეუსაბამო ნუკლეოტიდებს ჯაჭვის 3' ბოლოში.სწორი ნუკლეოტიდი შემდეგ იცვლება და დნმ-ის სინთეზი გრძელდება.არასწორი ნუკლეოტიდური თანმიმდევრობების იდენტიფიცირება ეფუძნება ფერმენტთან სწორი ნუკლეოზიდის ტრიფოსფატის შეკავშირების კავშირს, სადაც არაეფექტური შეკავშირება ანელებს სინთეზს და იძლევა სწორ ჩანაცვლების საშუალებას.Pfu პოლიმერაზას კორექტირების აქტივობა იწვევს ნაკლებ შეცდომებს საბოლოო თანმიმდევრობაში Taq დნმ პოლიმერაზასთან შედარებით.ბოლო წლებში იდენტიფიცირებული იქნა სხვა კორექტირების ფერმენტები და განხორციელდა ორიგინალური Pfu ფერმენტის მოდიფიკაციები, რათა კიდევ უფრო შემცირდეს შეცდომის მაჩვენებელი დნმ-ის გაძლიერებისას.

RT-PCR

საპირისპირო ტრანსკრიფცია PCR, ან RT-PCR, იძლევა რნმ-ის შაბლონად გამოყენების საშუალებას.დამატებითი ნაბიჯი იძლევა რნმ-ის აღმოჩენასა და გაძლიერებას.რნმ უკუ ტრანსკრიბირებულია დამატებით დნმ-ში (cDNA), საპირისპირო ტრანსკრიპტაზის გამოყენებით.რნმ-ის შაბლონის ხარისხი და სისუფთავე აუცილებელია RT-PCR-ის წარმატებისთვის.RT-PCR-ის პირველი ნაბიჯი არის დნმ/რნმ ჰიბრიდის სინთეზი.საპირისპირო ტრანსკრიპტაზას ასევე აქვს RNase H ფუნქცია, რომელიც ანადგურებს ჰიბრიდის რნმ ნაწილს.ერთჯაჭვიანი დნმ-ის მოლეკულა შემდეგ სრულდება საპირისპირო ტრანსკრიპტაზის დნმ-დამოკიდებული დნმ-პოლიმერაზას აქტივობით cDNA-ში.პირველი ჯაჭვის რეაქციის ეფექტურობამ შეიძლება გავლენა მოახდინოს გაძლიერების პროცესზე.აქედან მოყოლებული, სტანდარტული PCR პროცედურა გამოიყენება cDNA-ს გასაძლიერებლად.RT-PCR-ით რნმ-ის cDNA-ში გადაბრუნების შესაძლებლობას ბევრი უპირატესობა აქვს და იგი ძირითადად გამოიყენება გენის ექსპრესიის ანალიზისთვის.რნმ არის ერთჯაჭვიანი და ძალიან არასტაბილური, რაც რთულს ხდის მასთან მუშაობას.ის ჩვეულებრივ ემსახურება qPCR-ის პირველ საფეხურს, რომელიც რაოდენობრივად განსაზღვრავს რნმ-ის ტრანსკრიპტებს ბიოლოგიურ ნიმუშში.

qPCR და RT-qPCR

რაოდენობრივი PCR (qPCR) გამოიყენება ნუკლეინის მჟავების აღმოსაჩენად, დასახასიათებლად და რაოდენობრივად მრავალი გამოყენებისთვის.RT-qPCR-ში რნმ-ის ტრანსკრიპტები ხშირად რაოდენობრივად ფასდება მათი საპირისპირო ტრანსკრიფციით cDNA-ში ჯერ, როგორც აღწერილია ზემოთ, და შემდეგ შემდგომში ხორციელდება qPCR.როგორც სტანდარტული PCR-ში, დნმ ძლიერდება სამი განმეორებითი საფეხურით: დენატურაცია, ანილირება და დრეკადობა.თუმცა, qPCR-ში, ფლუორესცენტური მარკირება იძლევა მონაცემთა შეგროვების საშუალებას PCR პროგრესირებისას.ამ ტექნიკას ბევრი სარგებელი აქვს ხელმისაწვდომი მეთოდებისა და ქიმიის გამო.

საღებავზე დაფუძნებულ qPCR-ში (ჩვეულებრივ მწვანეში), ფლუორესცენტური მარკირება იძლევა გაძლიერებული დნმ-ის მოლეკულების რაოდენობრივ განსაზღვრას dsDNA დამაკავშირებელი საღებავის გამოყენებით.ყოველი ციკლის განმავლობაში, ფლუორესცენცია იზომება.ფლუორესცენციის სიგნალი იზრდება რეპლიკაციური დნმ-ის რაოდენობის პროპორციულად.აქედან გამომდინარე, დნმ რაოდენობრივად ფასდება „რეალურ დროში“ (ნახ. 3).საღებავზე დაფუძნებული qPCR-ის უარყოფითი მხარეა ის, რომ შესაძლებელია მხოლოდ ერთი სამიზნის გამოკვლევა ერთდროულად და რომ საღებავი დაუკავშირდება ნიმუშში არსებულ ნებისმიერ ds-დნმ-ს.

ზონდზე დაფუძნებულ qPCR-ში, მრავალი სამიზნე შეიძლება გამოვლინდეს ერთდროულად თითოეულ ნიმუშში, მაგრამ ეს მოითხოვს პრაიმერების გარდა გამოყენებული სამიზნე სპეციფიკური ზონდ(ებ)ის ოპტიმიზაციას და დიზაინს.ზონდის დიზაინის რამდენიმე სახეობაა ხელმისაწვდომი, მაგრამ ყველაზე გავრცელებული ტიპია ჰიდროლიზის ზონდი, რომელიც შეიცავს ფტორფორს და ჩამქრობას.ფლუორესცენტული რეზონანსული ენერგიის გადაცემა (FRET) ხელს უშლის ფტორფორის გამოყოფას ჩამქრობის საშუალებით, სანამ ზონდი ხელუხლებელია.თუმცა, PCR რეაქციის დროს, ზონდი ჰიდროლიზდება პრაიმერის გაფართოებისა და იმ სპეციფიკური თანმიმდევრობის გაძლიერების დროს, რომელსაც იგი უკავშირდება.ზონდის დაშლა გამოყოფს ფტორფორს ჩამქრალისგან და იწვევს ფლუორესცენციის ამპლიფიკაციაზე დამოკიდებულ ზრდას (ნახ. 4).ამრიგად, ზონდზე დაფუძნებული qPCR რეაქციის ფლუორესცენციული სიგნალი პროპორციულია ნიმუშში არსებული ზონდის სამიზნე თანმიმდევრობის რაოდენობისა.იმის გამო, რომ ზონდზე დაფუძნებული qPCR უფრო სპეციფიკურია, ვიდრე საღებავზე დაფუძნებული qPCR, ის ხშირად გამოიყენება qPCR-ზე დაფუძნებულ დიაგნოსტიკურ ანალიზებში.

იზოთერმული გაძლიერება

ზემოხსენებული PCR ტექნიკა მოითხოვს ძვირადღირებულ თერმოციკლური მოწყობილობას, რათა ზუსტად გაზარდოს და შეამციროს კამერის ტემპერატურა დენატურაციის, ანეილირების და გაფართოების საფეხურებისთვის.შემუშავებულია არაერთი ტექნიკა, რომელსაც არ სჭირდება ასეთი ზუსტი მოწყობილობები და შეიძლება შესრულდეს უბრალო წყლის აბაზანაში ან თუნდაც საინტერესო უჯრედებში.ამ ტექნიკას ერთობლივად უწოდებენ იზოთერმულ გაძლიერებას და მუშაობს ექსპონენციალურ, წრფივ ან კასკადურ გაძლიერებაზე.

იზოთერმული გაძლიერების ყველაზე ცნობილი ტიპია მარყუჟის შუამავლობით იზოთერმული გაძლიერება, ან LAMP.LAMP იყენებს ექსპონენციალურ გაძლიერებას 65⁰C-ზე შაბლონის დნმ-ის ან რნმ-ის გასაძლიერებლად.LAMP-ის შესრულებისას, სამიზნე დნმ-ის რეგიონების შემავსებელი ოთხი-ექვსი პრაიმერი გამოიყენება დნმ-პოლიმერაზასთან ერთად ახალი დნმ-ის სინთეზისთვის.ამ პრაიმერებიდან ორს აქვს დამატებითი თანმიმდევრობები, რომლებიც ამოიცნობს სხვა პრაიმერებში მიმდევრობებს და აკავშირებს მათ, რაც საშუალებას აძლევს შექმნას "მარყუჟის" სტრუქტურა ახლად სინთეზირებულ დნმ-ში, რომელიც შემდეგ ხელს უწყობს პრაიმერის ანეილირებას გაძლიერების შემდგომ რაუნდებში.LAMP-ის ვიზუალიზაცია შესაძლებელია მრავალი მეთოდით, მათ შორის ფლუორესცენციის, აგაროზის გელის ელექტროფორეზის ან კოლორიმეტრიის ჩათვლით.პროდუქტის არსებობის ან არარსებობის ვიზუალიზაციისა და გამოვლენის სიმარტივე კოლორიმეტრიით და საჭირო ძვირადღირებული აღჭურვილობის ნაკლებობამ LAMP გახადა შესაფერისი ვარიანტი SARS-CoV-2 ტესტირებისთვის იმ ადგილებში, სადაც კლინიკური ლაბორატორიული ტესტირება არ იყო ხელმისაწვდომი, ან ნიმუშების შენახვა და ტრანსპორტირება. არ იყო შესაძლებელი, ან ლაბორატორიებში, რომლებსაც ადრე არ ჰქონდათ PCR თერმოციკლური მოწყობილობა.