მე მჯერა, რომ PCR რეაქციების გაკეთებისას ყველას ყოველთვის შეექმნება ასეთი ან ისეთი პრობლემები, მაგრამ მათი უმეტესობა შეიძლება დაიყოს ორ მთავარ პრობლემად:

გენის შაბლონის ძალიან მცირე გაძლიერება (ამპლიფიკაცია);
ძალიან ბევრი არამიზნობრივი გენის გაძლიერება.
დანამატების გამოყენება ამ პრობლემების გადაჭრის ერთ-ერთი გავრცელებული სტრატეგიაა.ჩვეულებრივ, დანამატების როლს ორი ასპექტი აქვს:
მეორადი სტრუქტურაგენების (მეორადი სტრუქტურა);
შეამცირეთ არასპეციფიკური პრაიმინგი.
დღეს რედაქტორი მოკლედ გაგაცნობთ PCR რეაქციებში გავრცელებულ დანამატებს და მათ ფუნქციებს.
დანამატები, რომლებიც ამცირებენ მეორად სტრუქტურას
სულფოქსიდი(DMSO)
გენის ნიმუშებიმაღალი GC შემცველობით.თუმცა, DMSO ასევე მნიშვნელოვნად ამცირებს Taq პოლიმერაზას აქტივობას.ამიტომ, ყველამ უნდა დააბალანსოს შაბლონის ხელმისაწვდომობა და პოლიმერაზას აქტივობა.რედაქტორი ვარაუდობს, რომ შეგიძლიათ სცადოთ DSMO-ს სხვადასხვა კონცენტრაცია, როგორიცაა 2%-დან 10%-მდე, რათა იპოვოთ კონცენტრაცია, რომელიც შეესაბამება თქვენს ექსპერიმენტს.
არაიონური სარეცხი საშუალებები
არაიონური სარეცხი საშუალებები, როგორიცაა 0.1-1% Triton X-100, Tween 20 ან NP-40, ჩვეულებრივ ამცირებენ დნმ-ის მეორად სტრუქტურას.მიუხედავად იმისა, რომ ამან შეიძლება გაზარდოს შაბლონის გენის გაძლიერება, ის ასევე გამოიწვევს არასპეციფიკური ამპლიფიკაციის პრობლემას.ასე რომ, ეს დანამატები კარგად მუშაობს დაბალი მოსავლიანობის PCR რეაქციებზე ნამსხვრევების გარეშე, მაგრამ არც ისე კარგად შედარებით უწმინდური PRC რეაქციებისთვის.არაიონური სარეცხი საშუალებების კიდევ ერთი უპირატესობა არის SDS დაბინძურების შემცირება.ჩვეულებრივ, დნმ-ის ექსტრაქციის პროცესში, SDS მიიყვანება PCR საფეხურამდე, რაც მნიშვნელოვნად აფერხებს პოლიმერაზას აქტივობას.ამიტომ, რეაქციაში 0,5% Tween-20 ან Tween-40 დამატებამ შეიძლება გაანეიტრალოს SDS-ის უარყოფითი ეფექტი.
ბეტაინი_
ბეტაინს შეუძლია გააუმჯობესოს დნმ-ის გაძლიერება მეორადი სტრუქტურის ფორმირების შემცირებით და ზოგადად არის "საიდუმლო" დამატება კომერციული PCR კომპლექტებისთვის.თუ გსურთ ბეტაინის გამოყენება, უნდა დააყენოთ ბეტაინი ან ბეტაინის მონოჰიდრატი (ბეტაინი ან ბეტაინის მონოჰიდრატი), მაგრამ არა ბეტაინის ჰიდროქლორიდი (ბეტაინი HCl), დაარეგულიროთ საბოლოო კონცენტრაციაზე 1-1,7 მ.ბეტაინს ასევე შეუძლია დაეხმაროს სპეციფიკის გაუმჯობესებას, რადგან ის გამორიცხავს დნმ-ის დნობის/დნმ-ის დენატურაციის ბაზის წყვილის შემადგენლობის დამოკიდებულებას.
დანამატები არასპეციფიკური პრაიმინგის შესამცირებლად
ფორმამიდი
ფორმამიდი არის ხშირად გამოყენებული ორგანული PCR დანამატი.მას შეუძლია გაერთიანდეს დნმ-ის ძირითად ღართან და მცირე ღართან, რითაც ამცირებს მთავარი დნმ-ის ორმაგი სპირალის სტაბილურობას და ამცირებს დნმ-ის დნობის ტემპერატურას.PCR ექსპერიმენტებში გამოყენებული ფორმამიდის კონცენტრაცია ჩვეულებრივ არის 1%-5%.
ტეტრამეთილიამონიუმის ქლორიდი( TMAC)
ტეტრამეთილამონიუმის ქლორიდს შეუძლია გაზარდოს ჰიბრიდიზაციის სპეციფიკა (ჰიბრიდიზაციის სპეციფიკა) და გაზარდოს დნმ-ის დნობის ტემპერატურა.ამრიგად, TMAC-ს შეუძლია მოხსნას არასპეციფიკური პრაიმინგი და შეამციროს დნმ-ისა და რნმ-ის არასწორი შეკავშირება.თუ იყენებთგადაგვარებული პრაიმერებიPCR რეაქციაში გახსოვდეთ TMAC-ის დამატება, რომელიც ჩვეულებრივ გამოიყენება 15-100 მმ კონცენტრაციით.
სხვა საერთო დანამატები
გარდა ზემოთ ნახსენები დანამატების ორი კატეგორიისა, PCR რეაქციებში ბევრი საერთო დანამატია, თუმცა მათ აქვთ განსხვავებული ფუნქციები, ასევე ძალიან მნიშვნელოვანია.
მაგნიუმის იონი
მაგნიუმის იონი არის პოლიმერაზას შეუცვლელი კოფაქტორი (კოფაქტორი), ანუ მაგნიუმის იონის გარეშე პოლიმერაზა არააქტიურია.თუმცა, მაგნიუმის იონების ზედმეტმა რაოდენობამ ასევე შეიძლება გავლენა მოახდინოს პოლიმერაზას ეფექტურობაზე.მაგნიუმის იონების კონცენტრაცია თითოეულ PCR რეაქციაში განსხვავდება.ქელატური აგენტები (როგორიცაა EDTA ან ციტრატი), dNTP-ების და ცილების კონცენტრაცია ყველა გავლენას ახდენს მაგნიუმის იონების კონცენტრაციაზე.ასე რომ, თუ თქვენ გაქვთ პრობლემები PCR ექსპერიმენტთან დაკავშირებით, შეგიძლიათ სცადოთ მაგნიუმის იონის სხვადასხვა კონცენტრაციის შეცვლა, მაგალითად, 1.0-დან 4.0 მმ-მდე, შუალედში 0.5-1 მმ.
აღსანიშნავია, რომ გაყინვა-დათბობის მრავალჯერადი ციკლი შეიძლება გამოიწვიოს მაგნიუმის ქლორიდის ხსნარის კონცენტრაციის სტრატიფიკაცია.ამიტომ, ყოველი გამოყენების წინ ის მთლიანად უნდა დაითხოვოთ, გამოყენებამდე კი კარგად აურიოთ.
მსხვილფეხა რქოსანი შრატის ალბუმინი(მსხვილფეხა რქოსანი ალბუმინი, BSA)
მოლეკულური ქიმიის ექსპერიმენტებში მსხვილფეხა რქოსანი შრატის ალბუმინი არის ძალიან გავრცელებული დანამატი, განსაკუთრებით შემაკავებელი ფერმენტის მონელების და PCR ექსპერიმენტებში.PCR რეაქციებში, BSA სასარგებლოა დამაბინძურებლების შესამცირებლად, როგორიცაა ფენოლური ნაერთები.ასევე ნათქვამია, რომ მას შეუძლია შეამციროს რეაქტიული ნივთიერებების ადჰეზია ტესტის მილის კედელზე.PCR რეაქციაში, როგორც წესი, დამატებული BSA-ს კონცენტრაცია შეიძლება მიაღწიოს 0,8 მგ/მლ.
 
Მსგავსი პროდუქტები:
PCR გმირი(საღებავთან ერთად)
PCR გმირი