პრაიმერის დიზაინის საფუძველი (99% პრობლემების მოგვარება შესაძლებელია)
1. პრაიმერის სიგრძე: სახელმძღვანელოს სჭირდება 15-30bp, ჩვეულებრივ დაახლოებით 20bp.ფაქტობრივი მდგომარეობა უკეთესია იყოს 18-24bp სპეციფიკურობის უზრუნველსაყოფად, მაგრამ რაც უფრო გრძელია უკეთესი, ძალიან გრძელი პრაიმერი ასევე შეამცირებს სპეციფიკურობას და შეამცირებს მოსავლიანობას.
2. პრაიმერის გაძლიერების დიაპაზონი: 200-500bp არის შესაბამისი და ფრაგმენტი შეიძლება გაფართოვდეს 10kb-მდე კონკრეტულ პირობებში.
3. პრაიმერის ბაზა: G+C-ის შემცველობა უნდა იყოს 40-60%, ძალიან მცირე G+C ამპლიფიკაციის ეფექტი არ არის კარგი, ძალიან ბევრი G+C ადვილად ჩნდება არასპეციფიკური ზოლები.ATGC საუკეთესოდ ნაწილდება შემთხვევით, 5-ზე მეტი პურინის ან პირიმიდინის ნუკლეოტიდის კლასტერების თავიდან აცილების მიზნით.Multi-gc 5′ ბოლოსთვის და შუალედური თანმიმდევრობები სტაბილურობის გასაზრდელად, თავიდან აიცილეთ მდიდარი GC 3′ ბოლოს, GC არ არის ბოლო 3 ფუძისთვის, ან GC არ არის ბოლო 5 ბაზიდან 3.
4. მოერიდეთ პრაიმერებში მეორად სტრუქტურას და მოერიდეთ ორ პრაიმერს შორის კომპლემენტაციას, განსაკუთრებით კომპლემენტაციას მე-3 ბოლოში, წინააღმდეგ შემთხვევაში წარმოიქმნება პრაიმერის დიმერი და წარმოიქმნება არასპეციფიკური გაძლიერებული ზოლები.
5. პრაიმერების 3' ბოლოს ფუძეები, განსაკუთრებით ბოლო და ბოლო ფუძეები, მკაცრად უნდა იყოს დაწყვილებული, რათა თავიდან იქნას აცილებული PCR უკმარისობა დაუწყვილებელი ტერმინალური ბაზების გამო.
6. პრაიმერებს აქვთ ან შეიძლება დაემატოს შესაბამისი გაყოფის ადგილებს, და გაძლიერებულ სამიზნე თანმიმდევრობას სასურველია ჰქონდეს შესაბამისი გაყოფის ადგილები, რაც ძალიან სასარგებლოა გახლეჩის ანალიზისთვის ან მოლეკულური კლონირებისთვის.
7. პრაიმერების სპეციფიკა: პრაიმერებს არ უნდა ჰქონდეთ აშკარა ჰომოლოგია ნუკლეინის მჟავების თანმიმდევრობის მონაცემთა ბაზაში არსებულ სხვა თანმიმდევრობებთან.
8. ისწავლეთ პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენება: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (ეს ონლაინ დიზაინი საუკეთესოდ მუშაობს).
ზემოთ მოცემულ შინაარსს შეუძლია გადაჭრას პრაიმერის დიზაინის პრობლემების მინიმუმ 99%.
აკონტროლეთ პრაიმერის დიზაინის დეტალები
1. პრაიმერის სიგრძე
პრაიმერის საერთო სიგრძეა 18-30 ფუძე.ზოგადად, პრაიმერის დამუშავების ტემპერატურის განმსაზღვრელი ყველაზე მნიშვნელოვანი ფაქტორია პრაიმერის სიგრძე.პრაიმერის ადუღების ტემპერატურა ძირითადად არჩეულია (Tm მნიშვნელობა -5℃), ზოგი კი პირდაპირ იყენებს Tm მნიშვნელობას.შემდეგი ფორმულები შეიძლება გამოყენებულ იქნას პრაიმერების დამუშავების ტემპერატურის უხეშად გამოსათვლელად.
როდესაც პრაიმერის სიგრძე 20bp-ზე ნაკლებია: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
როდესაც პრაიმერის სიგრძე 20bp-ზე მეტია: 62.3℃+0.41℃(%GC)-500/სიგრძე-5℃
გარდა ამისა, მრავალი პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენება ასევე შესაძლებელია ანეილირების ტემპერატურის გამოსათვლელად, გაანგარიშების პრინციპი განსხვავებული იქნება, ამიტომ ზოგჯერ გამოთვლილ მნიშვნელობას შეიძლება ჰქონდეს მცირე უფსკრული.PCR რეაქციების ოპტიმიზაციისთვის, საუკეთესო ეფექტურობისა და სპეციფიკისთვის გამოიყენება უმოკლეს პრაიმერები, რომლებიც უზრუნველყოფენ ანეილირების ტემპერატურას არანაკლებ 54℃.
საერთო ჯამში, პრაიმერის სპეციფიკა იზრდება ოთხივე ფაქტორით ყოველი დამატებითი ნუკლეოტიდისთვის, ასე რომ, პრაიმერის მინიმალური სიგრძე უმეტესი გამოყენებისთვის არის 18 ნუკლეოტიდი.პრაიმერის სიგრძის ზედა ზღვარი არ არის ძალიან მნიშვნელოვანი, ძირითადად დაკავშირებულია რეაქციის ეფექტურობასთან.ენტროპიის გამო, რაც უფრო გრძელია პრაიმერი, მით უფრო დაბალია მისი ანელების სიჩქარე სამიზნე დნმ-თან შეერთების მიზნით, რათა შეიქმნას სტაბილური ორჯაჭვიანი შაბლონი დნმ-პოლიმერაზას დასაკავშირებლად.
პრაიმერების დიზაინისთვის პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებისას, პრაიმერების სიგრძე შეიძლება განისაზღვროს თავის მხრივ TM მნიშვნელობით, განსაკუთრებით ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR პრაიმერებისთვის, TM=60℃ ან მეტი უნდა იყოს კონტროლირებადი.
2.GC შინაარსი
ზოგადად, G+C-ის შემცველობა პრაიმერის თანმიმდევრობებში არის 40%-60%, ხოლო პრაიმერის წყვილის GC შემცველობა და Tm მნიშვნელობა კოორდინირებული უნდა იყოს.თუ პრაიმერს აქვს სერიოზული GC ან AT ტენდენცია, A, T ან G და C კუდის შესაბამისი რაოდენობა შეიძლება დაემატოს პრაიმერის 5' ბოლოს.
3. ანეილირების ტემპერატურა
გახეხვის ტემპერატურა უნდა იყოს 5℃-ით დაბალი ვიდრე ჯაჭვის ტემპერატურაზე.თუ პრაიმერის ბაზების რაოდენობა მცირეა, ანეილირების ტემპერატურა შეიძლება გაიზარდოს სათანადოდ, რამაც შეიძლება გაზარდოს PCR-ის სპეციფიკა.თუ ბაზების რაოდენობა დიდია, ანეილის ტემპერატურა შეიძლება სათანადოდ შემცირდეს.4℃ ~ 6℃ პრაიმერებს შორის ანეილის ტემპერატურის სხვაობა არ იმოქმედებს PCR-ის ეფექტურობაზე, მაგრამ იდეალურ შემთხვევაში, პრაიმერის წყვილის გამომუშავების ტემპერატურა იგივეა, რომელიც შეიძლება განსხვავდებოდეს 55℃ ~ 75℃ შორის.
4. მოერიდეთ გამაძლიერებელი შაბლონის მეორადი სტრუქტურის არეალს
გაძლიერებული ფრაგმენტის შერჩევისას უმჯობესია თავიდან აიცილოთ შაბლონის მეორადი სტრუქტურის რეგიონი.სამიზნე ფრაგმენტის სტაბილური მეორადი სტრუქტურის პროგნოზირება და შეფასება შესაძლებელია შესაბამისი კომპიუტერული პროგრამით, რაც გამოსადეგია შაბლონის არჩევისთვის.ექსპერიმენტული შედეგები აჩვენებს, რომ გაფართოება ხშირად წარუმატებელია, როდესაც გასაფართოვებელი რეგიონის თავისუფალი ენერგია (△G) არის 58,6 ლკჯ/მოლზე ნაკლები.
5. შეუსაბამობა სამიზნე დნმ-თან
როდესაც გაძლიერებული სამიზნე დნმ-ის თანმიმდევრობა დიდია, პრაიმერი შეიძლება დაუკავშირდეს სამიზნე დნმ-ის მრავალ ნაწილს, რის შედეგადაც შედეგში გამოჩნდება მრავალი ზოლი.ამჯერად აუცილებელია გამოიყენოთ BLAST პროგრამული ტესტირების ვებგვერდი:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.აირჩიეთ ორი მიმდევრობის გასწორება (bl2seq).
პრაიმერის თანმიმდევრობების ჩასმა 1-ლ ზონაში და სამიზნე დნმ-ის თანმიმდევრობების 2 ზონაში ურთიერთშემცვლელია და BLAST ითვლის დამატებით, ანტისენსეს და სხვა შესაძლებლობებს, ამიტომ მომხმარებლებს არ სჭირდებათ შეამჩნიონ, არის თუ არა ორივე ჯაჭვი გრძნობადი ჯაჭვები.თქვენ ასევე შეგიძლიათ შეიყვანოთ GI ნომერი, თუ იცით მიმდევრობის GI ნომერი მონაცემთა ბაზაში, ასე რომ თქვენ არ დაგჭირდებათ მიმდევრობის დიდი მონაკვეთის ჩასმა.დაბოლოს, დააწკაპუნეთ Align at 3, რათა ნახოთ, აქვს თუ არა პრაიმერს რამდენიმე ჰომოლოგიური ადგილი სამიზნე დნმ-ში.
6. პრაიმერის ტერმინალი
პრაიმერის 3' ბოლო არის იქ, სადაც იწყება გაფართოება, ამიტომ მნიშვნელოვანია, რომ თავიდან აიცილოთ შეუსაბამობები იქიდან.3' ბოლო არ უნდა იყოს 3 ზედიზედ G ან C-ზე მეტი, რადგან ეს გამოიწვევს პრაიმერის შეცდომით გააქტიურებას G+C გამდიდრების მიმდევრობის რეგიონში.3 'ბოლო ვერ წარმოქმნის მეორად სტრუქტურას, გარდა სპეციალური PCR (AS-PCR) რეაქციებისა, პრაიმერის 3' ბოლო არ შეიძლება შეუსაბამო.მაგალითად, თუ კოდირების რეგიონი გაძლიერებულია, პრაიმერის 3' ბოლო არ უნდა დასრულდეს კოდონის მესამე პოზიციაზე, რადგან კოდონის მესამე პოზიცია მიდრეკილია დეგენერაციისკენ, რაც გავლენას მოახდენს გაძლიერების სპეციფიკასა და ეფექტურობაზე.ანექსიური პრაიმერების გამოყენებისას მიმართეთ კოდონების გამოყენების ცხრილს, ყურადღება მიაქციეთ ბიოლოგიურ უპირატესობას, არ გამოიყენოთ ანექსიური პრაიმერები 3' ბოლოზე და გამოიყენეთ პრაიმერების უფრო მაღალი კონცენტრაცია (1uM-3uM).
7. პრაიმერების მეორადი სტრუქტურა
თავად პრაიმერებს არ უნდა ჰქონდეთ დამატებითი თანმიმდევრობა, წინააღმდეგ შემთხვევაში, თავად პრაიმერები იკეცება თმის სამაგრის სტრუქტურებად და ეს მეორადი სტრუქტურა გავლენას მოახდენს პრაიმერებისა და შაბლონების შეკავშირებაზე სტერული შეფერხების გამო.ხელოვნური განსჯის გამოყენების შემთხვევაში, თავად პრაიმერების უწყვეტი დამატებითი ფუძეები არ უნდა იყოს 3 bp-ზე მეტი.ორ პრაიმერს შორის არ უნდა არსებობდეს კომპლემენტარულობა, განსაკუთრებით 3' ბოლოს დამატებითი გადახურვა თავიდან უნდა იქნას აცილებული, რათა თავიდან იქნას აცილებული პრაიმერის დიმერების წარმოქმნა.ზოგადად, პრაიმერის წყვილს შორის არ უნდა იყოს არაუმეტეს 4 ზედიზედ ბაზის ჰომოლოგია ან კომპლემენტარულობა.
8. დაამატეთ მარკერები ან ადგილები
5 'ბოლო მცირე გავლენას ახდენს ამპლიფიკაციის სპეციფიკაზე და, შესაბამისად, შეიძლება შეიცვალოს გაძლიერების სპეციფიკაზე გავლენის გარეშე.პრაიმერის 5' ბოლოს მოდიფიკაცია მოიცავდა: ფერმენტის შეზღუდვის ადგილის დამატებას;ეტიკეტირებული ბიოტინი, ფლუორესცენცია, დიგოქსინი, Eu3+ და ა.შ. ცილებთან შემაკავშირებელი დნმ-ის თანმიმდევრობების დანერგვა;მუტაციის ადგილების შემოღება, მუტაციური თანმიმდევრობების ჩასმა და გამოტოვება და პრომოტორული თანმიმდევრობების შემოღება და ა.შ. დამატებითი ფუძეები მეტ-ნაკლებად იმოქმედებს გაძლიერების ეფექტურობაზე და გაზრდის პრაიმერის დიმერის ფორმირების შანსს, მაგრამ გარკვეული დათმობა უნდა გაკეთდეს შემდეგი ნაბიჯისთვის.დამატებითი თანმიმდევრობები, რომლებიც არ არსებობს სამიზნე თანმიმდევრობაზე, როგორიცაა შეზღუდვის ადგილები და პრომოტორული თანმიმდევრობა, შეიძლება დაემატოს პრაიმერის 5' ბოლოს სპეციფიკაზე გავლენის გარეშე.ეს თანმიმდევრობები არ შედის პრაიმერის Tm მნიშვნელობების გამოთვლაში, მაგრამ უნდა შემოწმდეს კომპლემენტარულობაზე და შიდა მეორად სტრუქტურაზე.
9. ქვეკლონები
უმეტეს შემთხვევაში, PCR არის მხოლოდ წინასწარი კლონირება და შემდეგ ჩვენ გვჭირდება სამიზნე ფრაგმენტის ქვეკლონირება სხვადასხვა ვექტორებში, ასე რომ, ჩვენ გვჭირდება დამატებითი ბაზების შემუშავება შემდეგი ოპერაციისთვის PCR საფეხურზე.
ქვეკლონირებისთვის განკუთვნილი ზოგიერთი თანმიმდევრობა შეჯამებულია ქვემოთ.
დაემატა შეზღუდვის ენდონუკლეაზას შეზღუდვის ადგილი
ფერმენტების შეზღუდვის ადგილების დამატება ყველაზე ხშირად გამოყენებული მეთოდია PCR პროდუქტების სუბკლონირებისთვის.ზოგადად, გაყოფის ადგილი არის ექვსი ფუძე, გარდა გაყოფის ადგილის 5' ბოლოსთვის საჭიროა 2 ~ 3 დამცავი ბაზის დამატება.თუმცა, სხვადასხვა ფერმენტისთვის საჭირო დამცავი ბაზების რაოდენობა განსხვავებულია.მაგალითად, SalⅠ არ საჭიროებს დამცავ ბაზას, EcoRⅤ მოითხოვს 1 დამცავ ბაზას, NotⅠ მოითხოვს 2 დამცავ ბაზას და Hind Ⅲ მოითხოვს 3 დამცავ ბაზას.
LIC ამატებს კუდს
LIC-ის სრული სახელია Ligation-Independent კლონირება, კლონირების მეთოდი, რომელიც გამოიგონა Navogen-ის მიერ სპეციალურად pET ვექტორის ნაწილისთვის.LIC მეთოდით მომზადებულ pET მატარებელს აქვს არაკომპლექტური 12-15 ბაზის ერთჯაჭვიანი წებოვანი ბოლოები, რომლებიც ავსებენ შესაბამის წებოვან ბოლოებს სამიზნე ჩანართის ფრაგმენტზე.ამპლიფიკაციის მიზნით, ჩასმული ფრაგმენტის პრაიმერის 5' თანმიმდევრობა უნდა ავსებდეს LIC ვექტორს.T4 დნმ პოლიმერაზას 3'→5' ექსტრანექტულმა აქტივობამ შეიძლება მცირე ხნის შემდეგ შექმნას ერთი ჯაჭვის წებოვანი ბოლო ჩასმული ფრაგმენტზე.იმის გამო, რომ პროდუქტის ჩამოყალიბება შესაძლებელია მხოლოდ მომზადებული ჩანართის ფრაგმენტისა და ვექტორის ურთიერთშედუღებით, ეს მეთოდი ძალიან სწრაფი და ეფექტურია და მიმართულია კლონირებაზე.
მიმართული TA კლონი დამატების კუდი
TA კლონირებამ ვერ შეძლო ფრაგმენტის დამიზნება ვექტორში, ამიტომ მოგვიანებით Invitrogen-მა შემოიტანა ვექტორი, რომელსაც შეეძლო კლონირება, რომელიც შეიცავდა ოთხ გამოჩენილ ბაზის GTGGS-ს ერთ ბოლოში.ამიტომ, PCR პრაიმერების დიზაინში, შესაბამისად უნდა დაემატოს დამატებითი თანმიმდევრობები, რათა ფრაგმენტები იყოს „ორიენტირებული“.
თუ დრო არ გაქვთ, შეგიძლიათ სცადოთ პირდაპირი სინთეზი, გენის გაერთიანება ვექტორთან, რასაც ჩვენ ვუწოდებთ ET გენის სინთეზს მუსკულარისტებში.
D. In-Fusion კლონირების მეთოდი
არ არის საჭირო ლიგაზა, არ არის საჭირო ხანგრძლივი რეაქცია.სანამ ხაზოვანი ვექტორის ორივე ბოლოში თანმიმდევრობაა დანერგილი პრაიმერების დიზაინში, შემდეგ PCR პროდუქტი და ხაზოვანი ვექტორი დაემატება BSA-ს შემცველ ფერმენტულ ხსნარს და მოთავსებულია ოთახის ტემპერატურაზე ნახევარი საათის განმავლობაში, ტრანსფორმაცია შეიძლება შესრულდეს.ეს მეთოდი განსაკუთრებით შესაფერისია დიდი მოცულობის კონვერტაციისთვის.
10. შერწყმა პრაიმერი
ზოგჯერ, მხოლოდ შეზღუდული თანმიმდევრობის ინფორმაცია ცნობილია პრაიმერის დიზაინის შესახებ.მაგალითად, თუ ცნობილია მხოლოდ ამინომჟავების თანმიმდევრობა, შერწყმის პრაიმერი შეიძლება შეიქმნას.შერწყმის პრაიმერი არის სხვადასხვა თანმიმდევრობის ნაზავი, რომელიც წარმოადგენს ყველა განსხვავებულ ბაზის შესაძლებლობას, რომელიც კოდირებს ერთ ამინომჟავას.სპეციფიკის გასაზრდელად, შეგიძლიათ მიმართოთ კოდონების გამოყენების ცხრილს, რათა შემცირდეს ანექსია სხვადასხვა ორგანიზმების ძირითადი გამოყენების პრეფერენციების მიხედვით.ჰიპოქსანტინი შეიძლება დაწყვილდეს ყველა ფუძესთან, რათა შემცირდეს პრაიმერის დუღილის ტემპერატურა.არ გამოიყენოთ მიმაგრებული ფუძეები პრაიმერის 3′ ბოლოზე, რადგან ბოლო 3 ბაზის ადუღება 3′ ბოლოზე საკმარისია PCR-ის არასწორ ადგილას დასაწყებად.პრაიმერის უფრო მაღალი კონცენტრაციები (1μM-დან 3μM-მდე) გამოიყენება, რადგან პრაიმერები ბევრ ანექსიურ ნარევში არ არის სპეციფიკური სამიზნე შაბლონისთვის.
PCR ნედლეულიკონტროლი
1. პრაიმერის რაოდენობა
თითოეული პრაიმერის კონცენტრაცია არის 0,1 ~ 1 მმოლი ან 10 ~ 100 პმოლი.სასურველი შედეგის მიღება უმჯობესია პრაიმერის მინიმალური რაოდენობით.პრაიმერის მაღალი კონცენტრაცია გამოიწვევს შეუსაბამობას და არასპეციფიკურ გაძლიერებას და გაზრდის პრაიმერებს შორის დიმერების წარმოქმნის შანსს.
2. პრაიმერის კონცენტრაცია
პრაიმერების კონცენტრაცია გავლენას ახდენს სპეციფიკაზე.პრაიმერის ოპტიმალური კონცენტრაცია ზოგადად 0.1-დან 0.5μM-მდეა.პრაიმერის უფრო მაღალი კონცენტრაცია იწვევს არასპეციფიკური პროდუქტების გაძლიერებას.
3. პრაიმერის დამუშავების ტემპერატურა
პრაიმერებისთვის კიდევ ერთი მნიშვნელოვანი პარამეტრია დნობის ტემპერატურა (Tm).ეს არის ტემპერატურა, როდესაც პრაიმერების და დამატებითი თანმიმდევრობების 50% წარმოდგენილია ორჯაჭვიანი დნმ-ის მოლეკულების სახით.Tm საჭიროა PCR ანეილირების ტემპერატურის დასაყენებლად.იდეალურ შემთხვევაში, ანეილირების ტემპერატურა საკმარისად დაბალია, რათა უზრუნველყოს პრაიმერების ეფექტური ანეილირება სამიზნე თანმიმდევრობით, მაგრამ საკმარისად მაღალია არასპეციფიკური შებოჭვის შესამცირებლად.გონივრული ანეილირების ტემპერატურა 55℃-დან 70℃-მდე.ანეილის ტემპერატურა ჩვეულებრივ დაყენებულია 5℃ პრაიმერის Tm-ზე დაბალი.
არსებობს რამდენიმე ფორმულა Tm-ის დასაყენებლად, რომლებიც მნიშვნელოვნად განსხვავდება გამოყენებული ფორმულისა და პრაიმერების თანმიმდევრობის მიხედვით.იმის გამო, რომ ფორმულების უმეტესობა იძლევა სავარაუდო Tm მნიშვნელობას, ანეილირების ყველა ტემპერატურა მხოლოდ საწყისი წერტილია.სპეციფიკურობა შეიძლება გაუმჯობესდეს რამდენიმე რეაქციის ანალიზით, რომლებიც თანდათან ამაღლებს ანელაციის ტემპერატურას.დაიწყეთ სავარაუდო Tm-5℃-ზე დაბლა და თანდათან გაზარდეთ დუღილის ტემპერატურა 2℃-ით.დუღილის უფრო მაღალი ტემპერატურა შეამცირებს პრაიმერის დიმერების და არასპეციფიკური პროდუქტების წარმოქმნას.საუკეთესო შედეგისთვის, ორ პრაიმერს უნდა ჰქონდეს მიახლოებითი Tm მნიშვნელობები.თუ პრაიმერის წყვილთა Tm სხვაობა 5℃-ზე მეტია, პრაიმერები აჩვენებენ მნიშვნელოვან ცრუ დაწყებას ციკლში დუღილის დაბალი ტემპერატურის გამოყენებით.თუ ორი პრაიმერი Tm განსხვავებულია, დააყენეთ დუღილის ტემპერატურა 5℃ დაბალზე, ვიდრე ყველაზე დაბალი Tm.ალტერნატიულად, სპეციფიკურობის გასაზრდელად, ხუთი ციკლი შეიძლება შესრულდეს ჯერ დუღილის ტემპერატურაზე, რომელიც გათვლილია უფრო მაღალ Tm-ზე, შემდეგ კი დარჩენილი ციკლები ადუღების ტემპერატურაზე, რომელიც განკუთვნილია ქვედა Tm-სთვის.ეს საშუალებას გაძლევთ მიიღოთ დანიშნულების შაბლონის ნაწილობრივი ასლი მჭიდრო პირობებში.
4. პრაიმერის სისუფთავე და სტაბილურობა
მორგებული პრაიმერების სტანდარტული სისუფთავე ადეკვატურია PCR აპლიკაციების უმეტესობისთვის.ბენზოილის და იზობუტილილის ჯგუფების მოცილება მარილის მოცილებით მინიმალურია და, შესაბამისად, არ ერევა PCR-ში.ზოგიერთი აპლიკაცია მოითხოვს გაწმენდას სინთეზის პროცესში ნებისმიერი არასრული სიგრძის თანმიმდევრობის მოსაშორებლად.ეს შეკვეცილი თანმიმდევრობები წარმოიქმნება იმის გამო, რომ დნმ-ის სინთეზის ქიმიის ეფექტურობა არ არის 100%.ეს არის წრიული პროცესი, რომელიც იყენებს განმეორებით ქიმიურ რეაქციებს, რადგან თითოეულ ფუძეს ემატება დნმ 3′-დან 5′-მდე.თქვენ შეგიძლიათ წარუმატებლობა ნებისმიერ ციკლში.უფრო გრძელ პრაიმერებს, განსაკუთრებით მათ 50 ფუძეზე მეტი, აქვთ შეკვეცილი თანმიმდევრობების დიდი ნაწილი და შეიძლება მოითხოვონ გაწმენდა.
პრაიმერების მოსავლიანობაზე გავლენას ახდენს სინთეზური ქიმიის ეფექტურობა და გამწმენდი მეთოდი.ბიოფარმაცევტული კომპანიები, როგორიცაა ციტოლოგია და შენგონგი, ყველა იყენებს მინიმალურ OD ერთეულს ოლიგონუკლეოზიდის მთლიანი გამომუშავების უზრუნველსაყოფად.მორგებული პრაიმერები იგზავნება მშრალი ფხვნილის სახით.უმჯობესია პრაიმერების ხელახლა დაშლა TE-ში ისე, რომ საბოლოო კონცენტრაცია იყოს 100μM.TE უკეთესია, ვიდრე დეიონიზებული წყალი, რადგან წყლის pH ხშირად მჟავეა და იწვევს ოლიგონუკლეოზიდების ჰიდროლიზს.
პრაიმერების სტაბილურობა დამოკიდებულია შენახვის პირობებზე.მშრალი ფხვნილი და გახსნილი პრაიმერები უნდა ინახებოდეს -20℃ ტემპერატურაზე.TE-ში გახსნილი პრაიმერები 10μM-ზე მეტი კონცენტრაციით შეიძლება სტაბილურად ინახებოდეს -20℃ ტემპერატურაზე 6 თვის განმავლობაში, მაგრამ მხოლოდ ოთახის ტემპერატურაზე (15℃-დან 30℃-მდე) 1 კვირაზე ნაკლები დროის განმავლობაში.მშრალი ფხვნილის პრაიმერების შენახვა შესაძლებელია -20 C ტემპერატურაზე მინიმუმ 1 წლის განმავლობაში და ოთახის ტემპერატურაზე (15 C-დან 30 C-მდე) 2 თვემდე.
5. ფერმენტები და მათი კონცენტრაციები
ამჟამად გამოყენებული Taq დნმ პოლიმერაზა ძირითადად არის გენის ინჟინერიის ფერმენტი, რომელიც სინთეზირებულია კოლიფორმული ბაქტერიებით.ტიპიური PCR რეაქციის კატალიზებისთვის საჭირო ფერმენტის რაოდენობა არის დაახლოებით 2.5 U (იგულისხმება რეაქციის მთლიანი მოცულობა 100 მლ).თუ კონცენტრაცია ძალიან მაღალია, შეიძლება გამოიწვიოს არასპეციფიკური გაძლიერება;თუ კონცენტრაცია ძალიან დაბალია, სინთეზური პროდუქტის რაოდენობა შემცირდება.
6. dNTP-ის ხარისხი და კონცენტრაცია
dNTP-ის ხარისხი მჭიდროდ არის დაკავშირებული PCR გაძლიერების კონცენტრაციასთან და ეფექტურობასთან.dNTP ფხვნილი მარცვლოვანია და მისი ცვალებადობა კარგავს თავის ბიოლოგიურ აქტივობას, თუ ის არასწორად ინახება.dNTP ხსნარი არის მჟავე და უნდა იქნას გამოყენებული მაღალი კონცენტრაციით, 1M NaOH ან 1M Tris.HCL ბუფერული ხსნარით მისი PH 7.0 ~ 7.5-მდე დასარეგულირებლად, მცირე რაოდენობის ქვეშეფუთვა, გაყინული შენახვა -20℃-ზე.მრავალჯერადი გაყინვა-დათბობა გამოიწვევს dNTP-ს დეგრადაციას.PCR რეაქციაში dNTP უნდა იყოს 50 ~ 200 მმოლ/ლ.განსაკუთრებით, ყურადღება უნდა მიექცეს ოთხი DNTPS-ის კონცენტრაციას თანაბარი (თანაბარი მოლის მომზადება).თუ რომელიმე მათგანის კონცენტრაცია განსხვავდება სხვებისგან (უფრო მაღალი ან დაბალი), წარმოიქმნება შეუსაბამობა.ძალიან დაბალი კონცენტრაცია შეამცირებს PCR პროდუქტების მოსავალს.dNTP შეიძლება გაერთიანდეს Mg2+-თან და შეამციროს თავისუფალი Mg2+ კონცენტრაცია.
7. შაბლონი (სამიზნე გენი) ნუკლეინის მჟავა
შაბლონის ნუკლეინის მჟავის რაოდენობა და გაწმენდის ხარისხი არის ერთ-ერთი მთავარი რგოლი PCR-ის წარმატებისა თუ წარუმატებლობისთვის.დნმ-ის გაწმენდის ტრადიციული მეთოდები ჩვეულებრივ იყენებენ SDS-ს და პროტეაზა K-ს ნიმუშების მოსანელებლად და განკარგვის მიზნით.SDS-ის ძირითადი ფუნქციებია: ლიპიდების და ცილების დაშლა უჯრედის მემბრანაზე, რითაც ანადგურებს უჯრედის მემბრანას მემბრანის ცილების დაშლით და უჯრედში ბირთვული ცილების დისოციაციას, SDS ასევე შეიძლება გაერთიანდეს ცილებთან და მოახდინოს ნალექი;პროტეაზა K-ს შეუძლია ცილების, განსაკუთრებით დნმ-თან შეკრული ჰისტონების ჰიდროლიზება და მონელება, შემდეგ კი გამოიყენოს ორგანული გამხსნელი ფენოლი და ქლოროფორმი ცილების და უჯრედის სხვა კომპონენტების მოსაპოვებლად, ხოლო ეთანოლის ან იზოპროპილის სპირტის გამოყენება ნუკლეინის მჟავას დასალექად.მოპოვებული ნუკლეინის მჟავა შეიძლება გამოყენებულ იქნას როგორც შაბლონი PCR რეაქციებისთვის.ზოგადი კლინიკური გამოვლენის ნიმუშებისთვის, სწრაფი და მარტივი მეთოდი შეიძლება გამოყენებულ იქნას უჯრედების დასაშლელად, პათოგენების ლიზატირებისთვის, ქრომოსომებიდან ცილების გადასაღებად და თავისუფალ სამიზნე გენებამდე და პირდაპირ გამოყენება PCR გაძლიერებისთვის.რნმ შაბლონის ექსტრაქცია ჩვეულებრივ იყენებს გუანიდინის იზოთიოციანატს ან პროტეაზა K მეთოდს, რათა თავიდან აიცილოს RNase რნმ-ის დეგრადირება.
8.მგ2+ კონცენტრაცია
Mg2+ მნიშვნელოვან გავლენას ახდენს PCR გაძლიერების სპეციფიკასა და გამოსავალზე.ზოგადად PCR რეაქციაში, როდესაც სხვადასხვა dNTP-ის კონცენტრაცია არის 200 მმოლ/ლ, Mg2+-ის შესაბამისი კონცენტრაცია არის 1,5 ~ 2,0 მმოლ/ლ.Mg2+ კონცენტრაცია ძალიან მაღალია, რეაქციის სპეციფიკა მცირდება, ხდება არასპეციფიკური გაძლიერება, ძალიან დაბალი კონცენტრაცია შეამცირებს Taq დნმ პოლიმერაზას აქტივობას, რაც გამოიწვევს რეაქციის პროდუქტების შემცირებას.
მაგნიუმის იონები გავლენას ახდენენ PCR-ის რამდენიმე ასპექტზე, როგორიცაა დნმ პოლიმერაზას აქტივობა, რაც გავლენას ახდენს მოსავლიანობაზე;კიდევ ერთი მაგალითია პრაიმერის ანილირება, რომელიც გავლენას ახდენს სპეციფიკაზე.dNTP და შაბლონი უკავშირდება მაგნიუმის იონს, ამცირებს თავისუფალი მაგნიუმის იონის რაოდენობას, რომელიც საჭიროა ფერმენტის აქტივობისთვის.მაგნიუმის იონის ოპტიმალური კონცენტრაცია მერყეობს სხვადასხვა პრაიმერის წყვილებისთვის და შაბლონებისთვის, მაგრამ ტიპიური PCR საწყისი კონცენტრაცია 200μM dNTP არის 1.5 მმ (შენიშვნა: რეალურ დროში რაოდენობრივი PCR-ისთვის გამოიყენეთ 3-დან 5 მმ-მდე მაგნიუმის იონის ხსნარი ფლუორესცენტური ზონდით).თავისუფალი მაგნიუმის იონების უფრო მაღალი კონცენტრაცია ზრდის მოსავლიანობას, მაგრამ ასევე ზრდის არასპეციფიკურ გაძლიერებას და ამცირებს ერთგულებას.ოპტიმალური კონცენტრაციის დასადგენად, მაგნიუმის იონების ტიტრირება შესრულდა 0.5 მმ-ით 1 მმ-დან 3 მმ-მდე.მაგნიუმის იონების ოპტიმიზაციაზე დამოკიდებულების შესამცირებლად შეიძლება გამოყენებულ იქნას Platinum Taq დნმ პოლიმერაზა.პლატინის Taq დნმ პოლიმერაზას შეუძლია შეინარჩუნოს ფუნქცია მაგნიუმის იონების კონცენტრაციების უფრო ფართო დიაპაზონში, ვიდრე Taq დნმ პოლიმერაზა და ამიტომ მოითხოვს ნაკლებ ოპტიმიზაციას.
9. Pcr-ის ხელშემწყობი დანამატები
დამუშავების ტემპერატურის, პრაიმერის დიზაინის და მაგნიუმის იონების კონცენტრაციის ოპტიმიზაცია საკმარისია შაბლონების უმეტესობის მაღალ სპეციფიკური გაძლიერებისათვის;თუმცა, ზოგიერთი შაბლონი, მათ შორის მაღალი GC შემცველობის მქონე შაბლონები, საჭიროებს დამატებით ზომებს.დანამატები, რომლებიც გავლენას ახდენენ დნმ-ის დნობის ტემპერატურაზე, წარმოადგენენ პროდუქტის სპეციფიკურობისა და მოსავლიანობის გაუმჯობესების კიდევ ერთ გზას.საუკეთესო შედეგისთვის საჭიროა შაბლონის სრული დენატურაცია.
გარდა ამისა, მეორადი სტრუქტურა ხელს უშლის პრაიმერის დაკავშირებას და ფერმენტის გაფართოებას.
PCR დანამატები, მათ შორის ფორმამიდი, DMSO, გლიცერინი, ბეტაინი და PCRx გამაძლიერებელი ხსნარი, აძლიერებს ამპლიფიკაციას.მათი შესაძლო მექანიზმი არის დნობის ტემპერატურის შემცირება, რითაც ხელს უწყობს პრაიმერების ადუღებას და ხელს უწყობს დნმ პოლიმერაზას გაფართოებას მეორადი სტრუქტურის რეგიონში.PCRx Solution-ს სხვა უპირატესობები აქვს.მინიმალური მაგნიუმის იონების ოპტიმიზაცია საჭიროა Platinum Taq დნმ პოლიმერაზასთან და Platinum Pfx დნმ პოლიმერაზასთან გამოყენებისას.ამრიგად, პლატინის ტექნიკა შერწყმულია დანამატთან, რათა გაზარდოს სპეციფიკა, ხოლო შემცირდეს მესამე მიდგომის, მაგნიუმის იონის ოპტიმიზაციის დამოკიდებულების შემცირება.საუკეთესო შედეგისთვის, დანამატების კონცენტრაცია უნდა იყოს ოპტიმიზირებული, განსაკუთრებით DMSO, ფორმამიდი და გლიცერინი, რომლებიც თრგუნავენ Taq დნმ პოლიმერაზას.
10. ცხელი დაწყება
ცხელი დაწყების PCR არის ერთ-ერთი ყველაზე მნიშვნელოვანი მეთოდი PCR სპეციფიკის გასაუმჯობესებლად, გარდა კარგი პრაიმერის დიზაინისა.მიუხედავად იმისა, რომ Taq დნმ პოლიმერაზას დრეკადობის ოპტიმალური ტემპერატურაა 72℃, პოლიმერაზა აქტიური რჩება ოთახის ტემპერატურაზე.ამრიგად, არასპეციფიკური პროდუქტები იწარმოება, როდესაც შენახვის ტემპერატურა უფრო დაბალია, ვიდრე ანეილირების ტემპერატურა PCR რეაქციის მომზადების დროს და თერმული ციკლის დასაწყისში.ჩამოყალიბების შემდეგ, ეს არასპეციფიკური პროდუქტები ეფექტურად ძლიერდება.ცხელი დაწყების PCR განსაკუთრებით ეფექტურია, როდესაც პრაიმერის დიზაინისთვის გამოყენებული ადგილები შეზღუდულია გენეტიკური ელემენტების მდებარეობით, როგორიცაა ადგილზე მიმართული მუტაციები, ექსპრესიის კლონირება ან დნმ-ის ინჟინერიისთვის გამოყენებული გენეტიკური ელემენტების აგება და მანიპულირება.
Taq დნმ პოლიმერაზას აქტივობის შეზღუდვის საერთო მეთოდია ყინულზე PCR რეაქციის ხსნარის მომზადება და წინასწარ გახურებულ PCR აპარატში მოთავსება.ეს მეთოდი მარტივი და იაფია, მაგრამ ის არ ამთავრებს ფერმენტის აქტივობას და, შესაბამისად, სრულად არ გამორიცხავს არასპეციფიკური პროდუქტების გაძლიერებას.
თერმული პრაიმინგი ანელებს დნმ-ის სინთეზს არსებითი კომპონენტის ინჰიბირებით, სანამ PCR აპარატი არ მიაღწევს დენატურაციის ტემპერატურას.თერმული დაწყების მეთოდების უმეტესობა, მათ შორის Taq დნმ პოლიმერაზას დაგვიანებული დამატება, რთულია, განსაკუთრებით მაღალი გამტარუნარიანობის გამოყენებისთვის.სხვა თერმული პრაიმინგის მეთოდები იყენებენ ცვილის ფარს არსებითი კომპონენტის, მაგნიუმის იონების ან ფერმენტების ჩათვლით, ან რეაქტიული კომპონენტების ფიზიკურად იზოლირებისთვის, როგორიცაა შაბლონები და ბუფერები.თერმული ციკლის დროს ცვილის დნობისას სხვადასხვა კომპონენტები გამოიყოფა და ერთმანეთში აირია.ხელით ცხელი დაწყების მეთოდის მსგავსად, ცვილის ფარის მეთოდი რთულია და მიდრეკილია დაბინძურებისკენ და არ არის შესაფერისი მაღალი გამტარუნარიანობის გამოყენებისთვის.
პლატინის დნმ პოლიმერაზა მოსახერხებელი და ეფექტურია ავტომატური ცხელი დაწყების PCR-სთვის.პლატინის Taq დნმ პოლიმერაზა შედგება რეკომბინანტული Taq დნმ პოლიმერაზასგან შერწყმული მონოკლონურ ანტისხეულთან Taq დნმ პოლიმერაზას წინააღმდეგ.ანტისხეულები იქმნება PCR-ით, რათა დათრგუნონ ფერმენტის აქტივობა ხანგრძლივი ტემპერატურის შენარჩუნების დროს.Taq დნმ პოლიმერაზა გამოიყოფა რეაქციაში დენატურაციის ეტაპის 94℃ იზოლაციის დროს, აღადგენს პოლიმერაზას სრულ აქტივობას.თერმული ინიცირებისთვის ქიმიურად მოდიფიცირებული Taq დნმ პოლიმერაზასგან განსხვავებით, პლატინის ფერმენტი არ საჭიროებს ხანგრძლივ იზოლაციას 94℃ (10-დან 15 წუთამდე) პოლიმერაზას გასააქტიურებლად.PlatinumTaq დნმ პოლიმერაზასთან ერთად, Taq დნმ პოლიმერაზას აქტივობის 90% აღდგა 2 წუთის შემდეგ 94℃ ტემპერატურაზე.
11. Nest-PCR
გაძლიერების თანმიმდევრული რაუნდები წყობილი პრაიმერების გამოყენებით შეიძლება გააუმჯობესოს სპეციფიკა და მგრძნობელობა.პირველი რაუნდი არის სტანდარტული გაძლიერება 15-დან 20 ციკლამდე.საწყისი გამაძლიერებელი პროდუქტის მცირე ნაწილი განზავებულია 100-დან 1000-ჯერ და დაემატა გაძლიერების მეორე რაუნდს 15-დან 20 ციკლამდე.ალტერნატიულად, საწყისი გაძლიერებული პროდუქტის ზომა შეიძლება განისაზღვროს გელის გაწმენდით.გაძლიერების მეორე რაუნდში გამოიყენება წყობილი პრაიმერი, რომელსაც შეუძლია დაუკავშირდეს სამიზნე თანმიმდევრობას პირველი პრაიმერის შიგნით.Nested PCR-ის გამოყენება ამცირებს მრავალი სამიზნე ადგილის გაძლიერების შესაძლებლობას, რადგან არსებობს რამდენიმე სამიზნე თანმიმდევრობა, რომელიც ავსებს პრაიმერის ორივე კომპლექტს.ციკლების იგივე საერთო რაოდენობა (30-დან 40-მდე) იგივე პრაიმერებით აძლიერებდა არასპეციფიკურ ადგილებს.Nested PCR ზრდის შეზღუდული სამიზნე თანმიმდევრობების მგრძნობელობას (მაგ., იშვიათი mrnas) და აუმჯობესებს რთული PCRS-ის სპეციფიკას (მაგ. 5′ RACE).
12. დაღმავალი PCR
დაღმავალი PCR აუმჯობესებს სპეციფიკურობას PCR-ის პირველი რამდენიმე ციკლისთვის მკაცრი ანეილირების პირობების გამოყენებით.ციკლი იწყება დადუღების ტემპერატურაზე დაახლოებით 5℃ უფრო მაღალი ვიდრე სავარაუდო Tm, შემდეგ ყოველი ციკლი მცირდება 1℃-დან 2℃-მდე, სანამ დუღილის ტემპერატურა არ იქნება Tm 5℃ ქვემოთ.გაძლიერდება მხოლოდ დანიშნულების შაბლონი უმაღლესი ჰომოლოგიით.ეს პროდუქტები აგრძელებს გაფართოებას მომდევნო ციკლებში, რაც აჭარბებს გაძლიერებულ არასპეციფიკურ პროდუქტებს.დაღმავალი PCR გამოსადეგია მეთოდებისთვის, სადაც უცნობია ჰომოლოგიის ხარისხი პრაიმერსა და სამიზნე შაბლონს შორის, როგორიცაა AFLP დნმ-ის თითის ანაბეჭდი.
დაკავშირებული PCR კომპლექტები
2× PCR გმირიTMMix სისტემას აქვს უფრო მაღალი ტოლერანტობა PCR ინჰიბიტორების მიმართ, ვიდრე ჩვეულებრივი PCR Mix სისტემა და ადვილად უმკლავდება სხვადასხვა რთული შაბლონების PCR გაძლიერებას.უნიკალური რეაქციის სისტემა და მაღალი ეფექტურობის Taq Hero ხდის PCR რეაქციას უფრო მაღალი გაძლიერების ეფექტურობას, სპეციფიკას და მგრძნობელობას.
გაძლიერების უფრო მაღალი ეფექტურობა
მას აქვს 5'→3' დნმ პოლიმერაზას აქტივობა და 5'→3' ეგზონუკლეაზას აქტივობა, 3'→5' ეგზონუკლეაზას აქტივობის გარეშე.
რეალურ დროში PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
სპეციფიკური - ოპტიმიზებული ბუფერი და ცხელი დაწყების Taq ფერმენტი ხელს უშლის არასპეციფიკურ გაძლიერებას და პრაიმერის დიმერის წარმოქმნას
მაღალი მგრძნობელობა-შეიძლება აღმოაჩინოს შაბლონის დაბალი ასლები
ნაკრები იყენებს უნიკალურ Foregene-ის საპირისპირო ტრანსკრიფციის რეაგენტს და Foregene HotStar Taq დნმ პოლიმერაზას კომბინირებულ უნიკალურ რეაქციის სისტემასთან, რათა ეფექტურად გააუმჯობესოს რეაქციის გაძლიერების ეფექტურობა და სპეციფიკა.
გამოქვეყნების დრო: მაისი-09-2023
