RNase არის მგრძნობიარე სიტყვა, რომლის მოსმენა არ სურს ბევრ სტუდენტს, რომლებიც ხშირად ატარებენ რნმ-ის ექსტრაქციის ექსპერიმენტებს.სრულად შეიარაღებული რნმ, რომელიც საბოლოოდ იქნა მოპოვებული უაღრესად ტოქსიკური რეაგენტებით ფენოლითა და ქლოროფორმით, დაიშალა.არ შევურიგდები!!!დღეს მოდით გადავხედოთ ცნობილი რნასეს წარმოშობას.

რიბონუკლეაზა (RNase), ან RNase, არის ნუკლეაზა, რომელსაც შეუძლია რნმ-ის ჰიდროლიზება მცირე მოლეკულებად.RNase, როგორც მცირე მოლეკულის ცილა, უჩვეულოდ სტაბილურია .ჩვეულებრივი მაღალი ტემპერატურისა და მაღალი წნევის ორთქლის სტერილიზაცია და ცილის ინჰიბიტორები ვერ ახდენენ მის სრულ ინაქტივაციას.RNase-ის სტაბილურობა ძირითადად წარმოიქმნება სტრუქტურაში არსებული დისულფიდური ბმებიდან.მაგალითად, მსხვილფეხა რქოსანი პანკრეასის ხშირად გამოყენებული RNase შეიცავს მხოლოდ 124 ამინომჟავას, მაგრამ შეიცავს 4 დისულფიდურ ბმას.გოგირდის ბმა და დისულფიდური ბმა RNase-ს შესანიშნავი თერმული სტაბილურობით ანიჭებს.გარდა ამისა, რნაზას აქვს შედარებით მცირე მოლეკულური წონა და ხშირ შემთხვევაში შეუძლია სწრაფად აღადგინოს ორიგინალური კონფორმაცია.

გარდა იმისა, რომ უკიდურესად სტაბილურია,RNases არის ყველგან ლაბორატორიაში .RNase არის ბიოლოგიური თავდაცვის მექანიზმი.უჯრედისთვის ეგზოგენური რნმ ხშირად ფატალურია.ეგზოგენურ დნმ-თან შედარებით, ეგზოგენური რნმ ხშირად უფრო საშიშია.რნმ ბედნიერად ტრანსკრიბირებული და თარგმნილია, ამიტომ თითქმის ყველა ორგანიზმმა შექმნა RNases ეგზოგენური რნმ-ის შეჭრისგან თავის დასაცავად.მაშასადამე, ლაბორატორიაში კულტივირებული ბაქტერიული უჯრედები და თქვენ, ვინც რნმ-ს ამოიღებთ, გამოყოფთ RNase-ს არომატს.ადამიანის სხეულის სითხეები (ნერწყვი, ცრემლები და ა.შ.) შეიცავს დიდი რაოდენობით RNase-ს, ამიტომ არ იტიროთ, როდესაც რნმ დეგრადირებულია.რაც უფრო მეტს ტირი, მით უფრო უარესია რნმ-ის დეგრადაცია!!და დაიიუ არ არის შესაფერისი რნმ-ის ექსტრაქციისთვის!

გარდა ამისა, თქვენი ნაზი კანი ასევე შეიცავს უამრავ RNase-ს და მარკერები, პიპეტები, მაცივრის კარები და კარის სახელურები, რომლებსაც კანი შეეხო, ასევე შეიცავს RNase-ს.

ამდენი აურზაურით, მოდით შევხედოთ როგორ გავუმკლავდეთ RNase-ებს.

პირველი, რაზეც ყველა ფიქრობს რნმ-ის ამოღებისას არისDEPC(დიეთილის პიროკარბონატი).DEPC ძირითადად დენატურაციას უკეთებს ცილას RNase აქტიური ჯგუფის ჰისტიდინის იმიდაზოლის რგოლთან შერწყმით, რითაც თრგუნავს ფერმენტის აქტივობას.0.1% DEPC-ს შეუძლია უკეთესი მოცილების ეფექტი რნაზეზე, მაგრამ ყურადღება უნდა მივაქციოთ, რომ DEPC არის ცნობილი კანცეროგენი, ამიტომ განსაკუთრებული ყურადღება უნდა მიექცეს მის გამოყენებას.

RNase-სთვის უნდა დავიწყოთ ორი ასპექტიდან,პირველი არის ენდოგენური RNase-ის აქტივობის დათრგუნვა

ჩვეულებრივი რნმ-ის ექსტრაქციის რეაგენტები, როგორიცაა ტრიზოლში შემავალი გუანიდინის იზოთიოციანატი და DTT, შეუძლიათ გახსნას RNase-ს დისულფიდური ბმა, მაგრამ მაინც არის რამდენიმე RNase, განსაკუთრებით ქსოვილის ნიმუშებში, ამიტომ ყურადღება მიაქციეთ დაბალ ტემპერატურას.

1.ქსოვილის ნიმუში ამოღების შემდეგ დაუყოვნებლივ ჩაეფლო თხევად აზოტში ან კომერციულ რნმ-ის შესანარჩუნებელ ხსნარში.

2.უჯრედის ნიმუშის რნმ-ის ამოღების შემდეგ, დაამატეთ იგი ლიზისის ხსნარში და დალიეთ ყინულის კოლოფზე.

3. დასაფქვავად უმჯობესია გამოიყენოთ თხევადი აზოტი როდესაც ქსოვილის ნიმუშები ჰომოგენიზებულია.ელექტრო ჰომოგენიზატორის გამოყენებისას თხევადი აზოტის გარეშე, ყურადღება მიაქციეთ ჰომოგენატის ადაპტერის სრულად წინასწარ გაგრილებას.

მეორე არის ეგზოგენური დნაზა

1.იყავით შეიარაღებული, ჩაიცვით ლაბორატორიული ქურთუკი, გაიკეთეთ ნიღაბი და აუცილებლად ატარეთ ახალი ხელთათმანები (ასე ეკონომიური ნუ იქნებით!! უნდა აღინიშნოს, რომ ტრიზოლი არის სუპერ კოროზიული, ასევე ძალიან ძლიერია ხელთათმანების საშუალებით, ასე რომ არ იწვეთოთ ხელებზე).

2.ყველა გამოყენებული პიპეტის წვერები, EP მილები, PCR მილები და სხვა აღჭურვილობა უნდა იყოს დამუშავებული დე-RNase.მისი გაჟღენთვა შესაძლებელია 0.1% DEPC-ში და შემდეგ მაღალი წნევის ქვეშ.ყურადღება მიაქციეთ კვამლის გამწოვში მუშაობას.ადგილობრივ ტირანებს შეუძლიათ პირდაპირ იყიდონ სახარჯო მასალები ფერმენტების მოსაშორებლად.

PS: ნება მომეცით გითხრათ ზარმაცი მეთოდი.მიუხედავად იმისა, რომ მაღალი ტემპერატურა და მაღალი წნევა არ შეუძლია მთლიანად ამოიღოს RNase, ის ამოიღებს მის დიდ ნაწილს.2-ჯერ მაღალ ტემპერატურასა და მაღალ წნევას კარგი ეფექტი აქვს, ხოლო რნმ-ის ექსტრაქციას მცირე ეფექტი აქვს.

3.ალკოჰოლს შეუძლია ცილების დენატაცია,ასე რომ, რნმ-ის ექსტრაქციის ცხრილი შეიძლება წაშალოთ 75% ალკოჰოლით , და ხელთათმანები ასევე შეიძლება სპირტით.

4.საბოლოო რნმ-ის გამხსნელი ხსნარი და ცენტრიფუგის მილი ასევე უნდა იყოს დამუშავებული დე-RNase.DEPC წყალი არის საყოველთაოდ გამოყენებული რნმ-ის გამხსნელი ხსნარი.მოდით ვისაუბროთ DEPC წყლის მომზადების სწორ მეთოდზე (გახსოვდეთ, რომ ხელახლა შეფუთოთ კომერციული DEPC ყიდვისას)

დაუმატეთ DEPC ულტრასუფთა წყალს 1:1000-ზე, კარგად შეანჯღრიეთ, გააჩერეთ ღამით 37°C-ზე და სტერილიზაცია 121°C-ზე მაღალი ტემპერატურისა და მაღალი წნევის ქვეშ 15 წუთის განმავლობაში.DEPC წყალი შეიძლება ინახებოდეს -20°C ტემპერატურაზე 1 მლ ალიქვოტებში.

დაბოლოს, რომ შევაჯამოთ: დაბალი ტემპერატურა არის მთავარი, სახარჯო მასალები კარგად არის მოვლილი, სრულად შეიარაღებული და ნაკლები საუბარი!

ისე, ეს არის დღევანდელი სტრატეგიისთვის.გისურვებთ რნმ-ის მთელ კონცენტრაციას და სიწმინდეს, რაც თქვენ ახსენეთ.ორივე A260/A280 არის 2.0!!!

რა თქმა უნდა, თუ იყენებთ აოთახის ტემპერატურის საოპერაციო რნმ-ის ექსტრაქციის ნაკრები, შეიძლება არ წააწყდეთ ზემოთ ჩამოთვლილ პრობლემებს.

სამუშაო ოთახის ტემპერატურაზე, DNase-ის დამატების გარეშე, ამოიღებს მთლიან რნმ-ს უჯრედებიდან 11 წუთში, ხოლო მთლიანი რნმ-ის ექსტრაქტი ცხოველის ქსოვილებიდან ან მცენარეებიდან 30 წუთში.

საცდელი ნიმუშებისთვის გთხოვთ დაუკავშირდეთ:overseas@foregene.com

Მსგავსი პროდუქტები:

https://www.foreivd.com/cell-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/animal-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/plant-total-rna/