qPCR ექსპერიმენტებში პრაიმერის დიზაინი ასევე ძალიან მნიშვნელოვანი რგოლია.პრაიმერები შესაფერისია თუ არა, მჭიდრო კავშირშია იმასთან, აღწევს თუ არა ამპლიფიკაციის ეფექტურობა სტანდარტს, არის თუ არა გაძლიერებული პროდუქტები სპეციფიკური და ხელმისაწვდომია თუ არა ექსპერიმენტული შედეგები.
როგორ გავაუმჯობესოთ qPCR პრაიმერის სპეციფიკა?გაძლიერების მაღალი ეფექტურობა?
დღეს ჩვენ ერთად გადაგიყვანთ qPCR პრაიმერების შემუშავებაზე და ნებას მივცემთ qPCR პრაიმერის დიზაინი გახდეს ეფექტური ცოდნა ექსპერიმენტებში.
qPCR პრაიმერების დაპროექტებისას, ჩვეულებრივ, ყურადღება მიაქციეთ შემდეგ პუნქტებს: პრაიმერები მაქსიმალურად უნდა იყოს დაპროექტებული ინტრონების გასწვრივ, პროდუქტის სიგრძე უნდა იყოს 100-300 bp, Tm მნიშვნელობა უნდა იყოს რაც შეიძლება ახლოს 60°C-მდე, ხოლო ზემოთ და ქვედა დინების პრაიმერი უნდა იყოს მაქსიმალურად ახლოს, ხოლო პრაიმერის დასასრული უნდა იყოს G ან C და ა.შ.
1. პრაიმერების დიზაინი, რომლებიც მოიცავს ინტრონებს
qPCR პრაიმერების დიზაინის დროს, ინტრონებს შორის შექმნილი პრაიმერების არჩევისას შეიძლება თავიდან იქნას აცილებული gDNA შაბლონის გაძლიერება და ყველა პროდუქტი მიღებულია cDNA-ს ამპლიფიკაციის შედეგად, რაც გამორიცხავს gDNA-ს დაბინძურების გავლენას.
2. პრაიმერის სიგრძე
პრაიმერის სიგრძე ჩვეულებრივ 18-30 ნტ-ს შორისაა და გამაძლიერებელი პროდუქტის სიგრძე მაქსიმალურად უნდა იყოს კონტროლირებადი 100-300 bp შორის.
თუ პრაიმერი ძალიან მოკლეა, ეს გამოიწვევს არასპეციფიკურ გაძლიერებას, ხოლო თუ ის ძალიან გრძელია, ადვილად წარმოქმნის მეორად სტრუქტურას (როგორიცაა თმის სამაგრის სტრუქტურა).თუ ამპლიფიკაციის პროდუქტი ძალიან გრძელია, ის არ არის შესაფერისი პოლიმერაზას რეაქციისთვის, რაც გავლენას მოახდენს PCR გაძლიერების ეფექტურობაზე.
3. GC შინაარსი და Tm მნიშვნელობა
პრაიმერებში GC შემცველობა უნდა იყოს კონტროლირებადი 40%-დან 60%-მდე.თუ ის ძალიან მაღალია ან ძალიან დაბალია, ეს არ არის ხელსაყრელი რეაქციის დასაწყებად.წინა და საპირისპირო პრაიმერების GC შემცველობა უნდა იყოს ერთნაირი, რათა მივიღოთ იგივე Tm მნიშვნელობა და დადუღების ტემპერატურა.
Tm მნიშვნელობა უნდა იყოს 55-65°C-ს შორის შეძლებისდაგვარად, ზოგადად დაახლოებით 60°C, ხოლო Tm-ის მნიშვნელობა ზედა დინებისა და ქვედა დინების მიმართულებით უნდა იყოს რაც შეიძლება ახლოს, სასურველია არაუმეტეს 4°C.
4. მოერიდეთ A არჩევას პრაიმერის 3′ ბოლოს
როდესაც პრაიმერის 3′ დასასრული შეუსაბამოა, დიდი განსხვავებებია სხვადასხვა ბაზის სინთეზის ეფექტურობაში.როდესაც ბოლო ბაზა არის A, მას ასევე შეუძლია ჯაჭვის სინთეზის დაწყება შეუსაბამობის შემთხვევაშიც კი, ხოლო როდესაც ბოლო ბაზა არის T When, შეუსაბამობის ინდუქციის ეფექტურობა მნიშვნელოვნად მცირდება.ამიტომ, ეცადეთ, პრაიმერის 3′ ბოლოს A-ს არჩევას მოერიდოთ და უმჯობესია აირჩიოთ T.
თუ ეს არის ზონდის პრაიმერი, ზონდის 5' ბოლო არ შეიძლება იყოს G, რადგან მაშინაც კი, როდესაც ერთი G ბაზა დაკავშირებულია FAM ფლუორესცენტური რეპორტიორის ჯგუფთან, G ასევე შეუძლია ჩაქროს FAM ჯგუფის მიერ გამოსხივებული ფლუორესცენტური სიგნალი, რაც გამოიწვევს ცრუ უარყოფით შედეგებს.გამოჩენა.
5. ბაზის განაწილება
პრაიმერში ოთხი ფუძის განაწილება სასურველია იყოს შემთხვევითი, თავიდან აიცილოთ 3-ზე მეტი G ან C 3' ბოლოს და 3-ზე მეტი ზედიზედ.G ან C ადვილად წარმოქმნის დაწყვილებას GC-ით მდიდარ მიმდევრობის რეგიონში.
6. პრაიმერის დიზაინის რეგიონმა თავიდან უნდა აიცილოს რთული მეორადი სტრუქტურები.
მეორადი სტრუქტურა, რომელიც წარმოიქმნება გამაძლიერებელი პროდუქტის ერთი ჯაჭვით, გავლენას მოახდენს PCR-ის გლუვ პროგრესზე.წინასწარ პროგნოზირებით არის თუ არა მეორადი სტრუქტურა სამიზნე თანმიმდევრობაში, შეეცადეთ თავიდან აიცილოთ ეს რეგიონი პრაიმერების დიზაინში.
7. თავად პრაიმერები და პრაიმერებს შორის უნდა ეცადონ თავიდან აიცილონ თანმიმდევრული დამატებითი ბაზები.
არ შეიძლება არსებობდეს თანმიმდევრული 4 ბაზის კომპლემენტარულობა თავად პრაიმერსა და პრაიმერს შორის.თავად პრაიმერს არ უნდა ჰქონდეს დამატებითი თანმიმდევრობა, წინააღმდეგ შემთხვევაში ის იკეცება და წარმოქმნის თმის სამაგრის სტრუქტურას, რაც გავლენას მოახდენს პრაიმერის და შაბლონის ანეილირებაზე.
დამატებითი თანმიმდევრობები არ შეიძლება არსებობდეს ზემოთ და ქვედა დინების პრაიმერებს შორის.პრაიმერებს შორის კომპლემენტარულობა წარმოქმნის პრაიმერის დიმერებს, რაც შეამცირებს PCR-ის ეფექტურობას და გავლენას მოახდენს რაოდენობრივ სიზუსტეზეც კი.თუ პრაიმერი-დიმერის და თმის სამაგრის სტრუქტურები გარდაუვალია, △G მნიშვნელობა არ უნდა იყოს ძალიან მაღალი (უნდა იყოს 4,5 კკალ/მოლზე ნაკლები).
8. პრაიმერები აძლიერებენ სამიზნე კონკრეტულ პროდუქტს.
qPCR გამოვლენის საბოლოო მიზანი არის სამიზნე გენის სიმრავლის გაგება.თუ მოხდება არასპეციფიკური გაძლიერება, რაოდენობრივი მაჩვენებელი არაზუსტი იქნება.ამიტომ, პრაიმერების დაპროექტების შემდეგ, საჭიროა მათი ტესტირება BLAST-ით და პროდუქტების სპეციფიკა შედარებულია თანმიმდევრობის მონაცემთა ბაზაში.
შემდეგი, ჩვენ ვიღებთ ადამიანის GAS6 (ზრდის შეჩერების სპეციფიკური 6) გენს, როგორც მაგალითი qPCR პრაიმერების შესაქმნელად.
01 შეკითხვის გენი
ჰომო გაზი 6NCBI-ს მეშვეობით.აქ ყურადღება უნდა მივაქციოთ გენის სახელებისა და სახეობების შედარებას, რათა დავრწმუნდეთ, რომ ისინი თანმიმდევრულია.
02 იპოვეთ გენის თანმიმდევრობა
(1) თუ სამიზნე თანმიმდევრობა არის გენომიური დნმ, აირჩიეთ პირველი, რომელიც არის გენის გენომიური დნმ-ის თანმიმდევრობა.
(2) თუ სამიზნე თანმიმდევრობა არის mRNA, აირჩიეთ მეორე.შესვლის შემდეგ დააჭირეთ ღილაკს "CDS" ქვემოთ მოცემულ ცხრილში.ყავისფერი ფონის თანმიმდევრობა არის გენის კოდირების თანმიმდევრობა.
03 დიზაინის პრაიმერები
შეიყვანეთ Primer-BLAST ინტერფეისი
შეიყვანეთ გენის თანმიმდევრობის ნომერი ან თანმიმდევრობა Fasta ფორმატში ზედა მარცხენა მხარეს და შეავსეთ შესაბამისი პარამეტრები.

დააწკაპუნეთ „მიიღეთ პრაიმერები“ და NCBI გამოჩნდება და გეტყვით, რომ პარამეტრის ასეთი არჩევანი გაძლიერდება სხვა შერწყმის ვარიანტებზე.ჩვენ შეგვიძლია შევამოწმოთ შერწყმის სხვადასხვა ვარიანტები და წარვადგინოთ ისინი შესაბამისი პრაიმერის წყვილის მისაღებად (როგორც ნაჩვენებია ქვემოთ მოცემულ სურათზე).ამ პროცესს შეიძლება ათობით წამი დასჭირდეს.
ამ პრაიმერის წყვილების დადუღების ტემპერატურა დაახლოებით 60°C-ია.ექსპერიმენტის მიზნიდან გამომდინარე, შეარჩიეთ პრაიმერები ზომიერი სიგრძის, კარგი სპეციფიკისა და პრაიმერების ნაკლებად თვითშეავსებით ექსპერიმენტისთვის და წარმატების მაჩვენებელი საკმაოდ მაღალია!
04პრაიმერის სპეციფიკის შემოწმება
ფაქტობრივად, პრაიმერების დიზაინის გარდა, Primer-Blast-ს ასევე შეუძლია შეაფასოს ის პრაიმერები, რომლებიც ჩვენ თვითონ დავაპროექტეთ.დაბრუნდით პრაიმერის დიზაინის გვერდზე, შეიყვანეთ ჩვენს მიერ შემუშავებული ზედა და ქვედა დინების პრაიმერები და სხვა პარამეტრები არ დარეგულირდება.გაგზავნის შემდეგ, თქვენ ხედავთ, არსებობს თუ არა პრაიმერის წყვილი სხვა გენებზეც.თუ ყველა მათგანი ნაჩვენებია გენზე, რომლის გაძლიერებაც გვინდა, ეს მიუთითებს იმაზე, რომ ამ წყვილი პრაიმერის სპეციფიკა შესანიშნავია!(მაგალითად, ეს არის პრაიმერის მოთხოვნის ერთადერთი შედეგი!)

05 პრაიმერის ხარისხის შეფასება
რა სახის პრაიმერი არის „სრულყოფილი“ პრაიმერი, რომელიც აერთიანებს „სტანდარტამდე გამაძლიერებელი ეფექტურობას“, „პროდუქტის გაძლიერებულ მახასიათებლებს“ და „სანდო ექსპერიმენტულ შედეგებს“?
გაძლიერების ეფექტურობა

დნობის მრუდი
პრაიმერების ამპლიფიკაციის ეფექტურობა აღწევს 90%-110%-ს, რაც ნიშნავს, რომ გამაძლიერებელი ეფექტურობა კარგია, ხოლო დნობის მრუდი აქვს ერთი პიკი და ჩვეულებრივ Tm>80°C, რაც ნიშნავს, რომ გამაძლიერებელი სპეციფიკა კარგია.
 
Მსგავსი პროდუქტები:
რეალურ დროში PCR Easy–SYBR GREEN I
რეალურ დროში PCR Easy-Taqman