Ct მნიშვნელობა არის ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR-ის შედეგის ყველაზე მნიშვნელოვანი ფორმა.იგი გამოიყენება გენის გამოხატვის განსხვავებების ან გენის ასლის რაოდენობის გამოსათვლელად.მაშ, რა არის ფლუორესცენციის რაოდენობრივი მნიშვნელობის Ct მიჩნეული გონივრულად?როგორ უზრუნველვყოთ Ct მნიშვნელობის ეფექტური დიაპაზონი?

რა არის Ct მნიშვნელობა?
qPCR ამპლიფიკაციის პროცესის დროს, შესაბამისი რაოდენობის გამაძლიერებელი ციკლები (ციკლის ბარიერი), როდესაც გაძლიერებული პროდუქტის ფლუორესცენციული სიგნალი მიაღწევს დადგენილ ფლუორესცენციის ზღურბლს.C ნიშნავს ციკლს და T ნიშნავს ბარიერს.მარტივად რომ ვთქვათ, Ct მნიშვნელობა არის ციკლების რაოდენობა, რომელიც შეესაბამება, როდესაც საწყისი შაბლონის გაძლიერება აღწევს პროდუქტის გარკვეულ რაოდენობას qPCR-ში.ეგრეთ წოდებული „პროდუქტის გარკვეული რაოდენობა“ შემდგომში იქნება ახსნილი.

რას აკეთებს Ct მნიშვნელობა?

1. კავშირი ექსპონენციალურ გაძლიერებას, შაბლონის რაოდენობასა და Ct მნიშვნელობას შორის
იდეალურ შემთხვევაში, qPCR-ში გენები გროვდება ექსპონენციალური გაძლიერებით ციკლების გარკვეული რაოდენობის შემდეგ.კავშირი გამაძლიერებელი ციკლების რაოდენობასა და პროდუქტების რაოდენობას შორის არის: გაძლიერებული პროდუქტის რაოდენობა = საწყისი შაბლონის რაოდენობა × (1+En) ციკლების რაოდენობა.თუმცა, qPCR რეაქცია ყოველთვის არ არის იდეალურ სიტუაციაში.როდესაც გაძლიერებული პროდუქტის რაოდენობა აღწევს „გარკვეული პროდუქტის რაოდენობას“, ციკლების რაოდენობა ამ დროს არის Ct მნიშვნელობა და ის არის ექსპონენციალური გაძლიერების პერიოდში.ურთიერთობა Ct მნიშვნელობასა და საწყისი შაბლონის რაოდენობას შორის: არსებობს წრფივი კავშირი შაბლონის Ct მნიშვნელობასა და შაბლონის საწყისი ასლის ნომრის ლოგარითმს შორის.რაც უფრო მაღალია შაბლონის საწყისი კონცენტრაცია, მით უფრო მცირეა Ct მნიშვნელობა;რაც უფრო დაბალია შაბლონის საწყისი კონცენტრაცია, მით უფრო დიდია Ct მნიშვნელობა.

2. ამპლიფიკაციის მრუდი, ფლუორესცენციის ბარიერი და PCR პროდუქტის გარკვეული რაოდენობა
qPCR გამაძლიერებელი პროდუქტის რაოდენობა პირდაპირ არის წარმოდგენილი ფლუორესცენტური სიგნალის სახით, ანუ გამაძლიერებელი მრუდი.PCR-ის ადრეულ ეტაპზე გაძლიერება ხდება იდეალურ პირობებში, ციკლების რაოდენობა მცირეა, პროდუქტის დაგროვება მცირეა და ფლუორესცენციის დონე მკაფიოდ ვერ გამოირჩევა ფლუორესცენციული ფონისგან.ამის შემდეგ, ფლუორესცენცია იზრდება და შედის ექსპონენციურ ფაზაში.PCR პროდუქტის ოდენობა შეიძლება გამოვლინდეს გარკვეულ მომენტში, როდესაც PCR რეაქცია მხოლოდ ექსპონენციურ ფაზაშია, რომელიც შეიძლება გამოყენებულ იქნას როგორც "პროდუქტის გარკვეული რაოდენობა" და აქედან გამომდინარეობს შაბლონის საწყისი შინაარსი.ამიტომ, ფლუორესცენციის სიგნალის ინტენსივობა, რომელიც შეესაბამება პროდუქტის გარკვეულ რაოდენობას, არის ფლუორესცენციის ბარიერი.

PCR-ის გვიან ეტაპზე გაძლიერების მრუდი აღარ აჩვენებს ექსპონენციალურ გაძლიერებას და შედის ხაზოვან ფაზასა და პლატო ფაზაში.

3.Ct მნიშვნელობების განმეორებადობა
როდესაც PCR ციკლი მიაღწევს Ct მნიშვნელობის ციკლის რაოდენობას, ის ახლახან შევიდა ნამდვილ ექსპონენციალურ გაძლიერების პერიოდში.ამ დროს მცირე შეცდომა არ არის გაძლიერებული, ამიტომ Ct მნიშვნელობის განმეორებადობა შესანიშნავია, ანუ ერთი და იგივე შაბლონი გაძლიერებულია სხვადასხვა დროს ან სხვადასხვა მილში ერთდროულად.გაძლიერება, მიღებული Ct მნიშვნელობა მუდმივია.

1.ამპლიფიკაციის ეფექტურობა En
PCR გაძლიერების ეფექტურობა ეხება ეფექტურობას, რომლითაც პოლიმერაზა გარდაქმნის გასაძლიერებელ გენს ამპლიკონად.გაძლიერების ეფექტურობა, როდესაც ერთი დნმ-ის მოლეკულა გარდაიქმნება დნმ-ის ორ მოლეკულად, არის 100%.გამაძლიერებელი ეფექტურობა ჩვეულებრივ გამოიხატება როგორც En.შემდგომი სტატიების ანალიზის გასაადვილებლად, მოკლედ არის წარმოდგენილი ფაქტორები, რომლებიც გავლენას ახდენენ გაძლიერების ეფექტურობაზე.

2.Ct მნიშვნელობების დიაპაზონი
Ct მნიშვნელობები მერყეობს 15-35-მდე.თუ Ct მნიშვნელობა 15-ზე ნაკლებია, ითვლება, რომ გაძლიერება საბაზისო პერიოდის ფარგლებშია და ფლუორესცენციის ბარიერი არ არის მიღწეული.იდეალურ შემთხვევაში, არსებობს წრფივი კავშირი Ct მნიშვნელობასა და შაბლონის საწყისი ასლის ნომრის ლოგარითმს შორის, ანუ სტანდარტული მრუდი.სტანდარტული მრუდის მეშვეობით, როდესაც გაძლიერების ეფექტურობა არის 100%, გამოთვლილი Ct მნიშვნელობა გენის ერთი ასლის რიცხვის რაოდენობრივი დასადგენად არის დაახლოებით 35. თუ ის 35-ზე მეტია, თარგის საწყისი ასლის ნომერი თეორიულად 1-ზე ნაკლებია, რაც შეიძლება ჩაითვალოს უაზროდ.

სხვადასხვა გენის Ct დიაპაზონისთვის, გენის ასლის რიცხვის სხვაობისა და საწყის შაბლონში გაძლიერების ეფექტურობის გამო, აუცილებელია გენის სტანდარტული მრუდის გაკეთება და გენის ხაზოვანი გამოვლენის დიაპაზონის გამოთვლა.

3.Ct მნიშვნელობის გავლენის ფაქტორები
ამპლიფიკაციის ციკლების რაოდენობასა და პროდუქტის რაოდენობას შორის დამოკიდებულებიდან: გაძლიერებული პროდუქტის რაოდენობა = საწყისი შაბლონის რაოდენობა × (1+En) ციკლის ნომერი, ჩანს, რომ იდეალურ პირობებში, საწყისი შაბლონის და En-ის რაოდენობა უარყოფითად აისახება Ct მნიშვნელობაზე.შაბლონის ხარისხის ან გაძლიერების ეფექტურობის განსხვავება გამოიწვევს Ct-ის მნიშვნელობას ძალიან დიდი ან ძალიან მცირე.

4.Ct მნიშვნელობა არის ძალიან დიდი ან ძალიან მცირე