PCR (პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქცია) არის დნმ-ის გაძლიერების ინ-ვიტრო ტექნოლოგია, რომლის ისტორია 30 წელზე მეტია.

PCR ტექნოლოგია იყო პიონერი კარი მალისის მიერ ცეტუსიდან, აშშ 1983 წელს. მალისმა მიმართა PCR პატენტს 1985 წელს და იმავე წელს გამოაქვეყნა პირველი PCR აკადემიური ნაშრომი მეცნიერების შესახებ.მულისი 1993 წელს მიენიჭა ნობელის პრემია ქიმიაში მისი მუშაობისთვის.

PCR-ის ძირითადი პრინციპები

PCR-ს შეუძლია სამიზნე დნმ-ის ფრაგმენტების გაძლიერება მილიონზე მეტჯერ.პრინციპი ექვემდებარება დნმ პოლიმერაზას კატალიზებას, ძირითადი ჯაჭვის დნმ-ის გამოყენებით შაბლონად და სპეციფიკური პრაიმერი, როგორც გაფართოების საწყისი წერტილი.ის მრავლდება ინ ვიტრო საფეხურებით, როგორიცაა დენატურაცია, ანეილირება და გაფართოება.შვილობილი ჯაჭვის დნმ-ის პროცესი, რომელიც ავსებს მშობელი ჯაჭვის დნმ-ის შაბლონს.

სტანდარტული PCR პროცესი დაყოფილია სამ ეტაპად:

1. დენატურაცია: გამოიყენეთ მაღალი ტემპერატურა დნმ-ის ორმაგი ჯაჭვების გამოსაყოფად.წყალბადის ბმა დნმ-ის ორმაგ ჯაჭვებს შორის იშლება მაღალ ტემპერატურაზე (93-98℃).

2. Annealing: ორჯაჭვიანი დნმ-ის გამოყოფის შემდეგ შეამცირეთ ტემპერატურა ისე, რომ პრაიმერი დაუკავშირდეს ერთჯაჭვიან დნმ-ს.

3. გაფართოება: დნმ პოლიმერაზა იწყებს დამატებითი ჯაჭვების სინთეზს დნმ-ის ჯაჭვების გასწვრივ შეკრული პრაიმერებიდან ტემპერატურის დაწევისას.როდესაც გაფართოება დასრულდება, ციკლი სრულდება და დნმ-ის ფრაგმენტების რაოდენობა გაორმაგდება

ამ სამი ნაბიჯის 25-35-ჯერ გადაბრუნებით, დნმ-ის ფრაგმენტების რაოდენობა ექსპონენტურად გაიზრდება.

PCR-ის ინტელექტუალურობა იმაში მდგომარეობს, რომ სხვადასხვა პრაიმერი შეიძლება შეიქმნას სხვადასხვა სამიზნე გენისთვის, ასე რომ სამიზნე გენის ფრაგმენტები შეიძლება გაძლიერდეს მოკლე დროში.

ჯერჯერობით, PCR შეიძლება დაიყოს სამ კატეგორიად, კერძოდ, ჩვეულებრივი PCR, ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR და ციფრული PCR.

ჩვეულებრივი PCR-ის პირველი თაობა

გამოიყენეთ ჩვეულებრივი PCR ამპლიფიკაციის ინსტრუმენტი სამიზნე გენის გასაძლიერებლად, შემდეგ კი გამოიყენეთ აგაროზის გელის ელექტროფორეზი პროდუქტის გამოსავლენად, მხოლოდ ხარისხობრივი ანალიზი შეიძლება გაკეთდეს.

პირველი თაობის PCR-ის ძირითადი უარყოფითი მხარეები:

1.მიდრეკილება არასპეციფიკური გაძლიერებისა და ცრუ დადებითი შედეგებისკენ.

2. გამოვლენას დიდი დრო სჭირდება და ოპერაცია რთულია.

3.შესაძლებელია მხოლოდ ხარისხობრივი ტესტის ჩატარება

მეორე თაობის რეალურ დროში PCR

რეალურ დროში PCR, რომელიც ასევე ცნობილია როგორც qPCR, იყენებს ფლუორესცენტურ ზონდებს, რომლებსაც შეუძლიათ მიუთითონ რეაქციის სისტემის პროგრესი და აკონტროლებს გაძლიერებული პროდუქტების დაგროვებას ფლუორესცენტური სიგნალების დაგროვების გზით და განსჯის შედეგებს ფლუორესცენტური მრუდის მეშვეობით.მისი რაოდენობრივი დადგენა შესაძლებელია Cq მნიშვნელობისა და სტანდარტული მრუდის დახმარებით.

იმის გამო, რომ qPCR ტექნოლოგია ხორციელდება დახურულ სისტემაში, დაბინძურების ალბათობა მცირდება და ფლუორესცენტური სიგნალის მონიტორინგი შესაძლებელია რაოდენობრივი გამოვლენისთვის, ამიტომ ის ყველაზე ფართოდ გამოიყენება კლინიკურ პრაქტიკაში და გახდა დომინანტური ტექნოლოგია PCR-ში.

რეალურ დროში ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR-ში გამოყენებული ფლუორესცენტური ნივთიერებები შეიძლება დაიყოს: TaqMan ფლუორესცენტურ ზონდად, მოლეკულურ შუქურებად და ფლუორესცენტულ საღებად.

1) TaqMan ფლუორესცენტური ზონდი:

PCR გაძლიერების დროს ემატება სპეციფიკური ფლუორესცენტური ზონდი პრაიმერის წყვილის დამატებისას.ზონდი არის ოლიგონუკლეოტიდი და ორივე ბოლო მონიშნულია მომხსენებელი ფლუორესცენტური ჯგუფით და ჩამქრალი ფლუორესცენტური ჯგუფით.

როდესაც ზონდი ხელუხლებელია, რეპორტიორის ჯგუფის მიერ გამოსხივებული ფლუორესცენტური სიგნალი შეიწოვება ჩაქრობის ჯგუფის მიერ;PCR გაძლიერების დროს, Taq ფერმენტის 5'-3' ეგზონუკლეაზური აქტივობა წყვეტს და ანადგურებს ზონდს, ხდის რეპორტიორის ფლუორესცენტულ ჯგუფს და ჩაქრობს. ფლუორესცენციის სიგნალი მთლიანად სინქრონიზებულია PCR პროდუქტის ფორმირებასთან.

2) SYBR ფლუორესცენტური საღებავი:

PCR რეაქციის სისტემაში ემატება SYBR ფლუორესცენტური საღებავის ჭარბი რაოდენობა.მას შემდეგ, რაც SYBR ფლუორესცენტური საღებავი არასპეციფიკურად შედის დნმ-ის ორჯაჭვიანში, ის ასხივებს ფლუორესცენტურ სიგნალს.SYBR საღებავის მოლეკულა, რომელიც არ არის ჩართული ჯაჭვში, არ გამოსცემს ფლუორესცენტურ სიგნალს, რითაც უზრუნველყოფს ფლუორესცენტურ სიგნალს PCR პროდუქტების ზრდა მთლიანად სინქრონიზებულია PCR პროდუქტების ზრდასთან.SYBR უკავშირდება მხოლოდ ორჯაჭვიან დნმ-ს, ამიტომ დნობის მრუდი შეიძლება გამოყენებულ იქნას იმის დასადგენად, არის თუ არა PCR რეაქცია სპეციფიკური.

3) მოლეკულური შუქურა:

ეს არის ღეროვანი მარყუჟის ორმაგი მარკირებული ოლიგონუკლეოტიდური ზონდი, რომელიც ქმნის დაახლოებით 8 ფუძის სტრუქტურას მე-5 და მე-3 ბოლოებზე.ნუკლეინის მჟავების თანმიმდევრობა ორივე ბოლოში არის დაწყვილებული, რაც იწვევს ფლუორესცენტური ჯგუფის და ჩაქრობის ჯგუფს მჭიდროდ.დახურეთ, ფლუორესცენცია არ იქნება წარმოებული.

PCR პროდუქტის გენერირების შემდეგ, ანეილირების პროცესის დროს, მოლეკულური შუქურის შუა ნაწილი წყვილდება დნმ-ის სპეციფიკურ თანმიმდევრობასთან და ფლუორესცენტური გენი გამოყოფილია ჩამქრალი გენისაგან ფლუორესცენციის წარმოქმნით.

მეორე თაობის PCR-ის ძირითადი უარყოფითი მხარეები:

მგრძნობელობა ჯერ კიდევ აკლია და დაბალი ასლის ნიმუშების აღმოჩენა არაზუსტია.

არსებობს ფონის მნიშვნელობის გავლენა და შედეგი ექვემდებარება ჩარევას.

როდესაც რეაქციის სისტემაში არის PCR ინჰიბიტორები, გამოვლენის შედეგები ექვემდებარება ჩარევას.

მესამე თაობის ციფრული PCR

ციფრული PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) ითვლის სამიზნე თანმიმდევრობის ასლის რაოდენობას ბოლო წერტილის გამოვლენის გზით და შეუძლია შეასრულოს ზუსტი აბსოლუტური რაოდენობრივი გამოვლენა შიდა კონტროლისა და სტანდარტული მრუდების გამოყენების გარეშე.

ციფრული PCR იყენებს საბოლოო წერტილის გამოვლენას და არ არის დამოკიდებული Ct მნიშვნელობაზე (ციკლის ბარიერი), ასე რომ ციფრული PCR რეაქციაზე ნაკლებად მოქმედებს გაძლიერების ეფექტურობა და PCR რეაქციის ინჰიბიტორების მიმართ ტოლერანტობა გაუმჯობესებულია, მაღალი სიზუსტითა და გამეორებით.

მაღალი მგრძნობელობისა და მაღალი სიზუსტის მახასიათებლების გამო, მას ადვილად არ ერევა PCR რეაქციის ინჰიბიტორები და მას შეუძლია მიაღწიოს ნამდვილ აბსოლუტურ რაოდენობებს სტანდარტული პროდუქტების გარეშე, რაც გახდა კვლევისა და გამოყენების ცხელ წერტილად.

რეაქციის ერთეულის სხვადასხვა ფორმის მიხედვით, ის შეიძლება დაიყოს სამ ძირითად ტიპად: მიკროსთხევად, ჩიპურ და წვეთოვან სისტემებად.

1) მიკროფლუიდური ციფრული PCR, mdPCR:

მიკროფლუიდური ტექნოლოგიის საფუძველზე ხდება დნმ-ის შაბლონის გამოყოფა.მიკროსთხევად ტექნოლოგიას შეუძლია განახორციელოს ნიმუშის ნანო-განახლება ან უფრო პატარა წვეთების წარმოქმნა, მაგრამ წვეთებს სჭირდებათ სპეციალური ადსორბციის მეთოდი და შემდეგ შერწყმულია PCR რეაქციის სისტემასთან.mdPCR თანდათან მიღებულ იქნა სხვა მეთოდებით.

2) წვეთებზე დაფუძნებული ციფრული PCR, ddPCR:

გამოიყენეთ წყალში ზეთის წვეთების წარმოქმნის ტექნოლოგია ნიმუშის წვეთებად დასამუშავებლად და დაყავით რეაქციის სისტემა, რომელიც შეიცავს ნუკლეინის მჟავას მოლეკულებს ათასობით ნანომასშტაბიან წვეთებად, რომელთაგან თითოეული არ შეიცავს ნუკლეინის მჟავას სამიზნე მოლეკულას, რომელიც უნდა აღმოაჩინოს, ან შეიცავს ერთიდან რამდენიმე ნუკლეინის მჟავას სამიზნე მოლეკულას შესამოწმებლად.

3) ჩიპზე დაფუძნებული ციფრული PCR, cdPCR:

გამოიყენეთ სითხის გზის ინტეგრირებული ტექნოლოგია მრავალი მიკრომილისა და მიკროკავის ამოსატვიფრად სილიკონის ვაფლებზე ან კვარცის მინაზე და აკონტროლეთ ხსნარის ნაკადი სხვადასხვა საკონტროლო სარქველების მეშვეობით და დაყავით სინჯის სითხე იმავე ზომის ნანომეტრებად ციფრული PCR რეაქციისთვის ციფრული PCR რეაქციისთვის.

მესამე თაობის PCR-ის ძირითადი უარყოფითი მხარეები:

აღჭურვილობა და რეაგენტები ძვირია.

შაბლონის ხარისხის მოთხოვნები მაღალია.თუ შაბლონის რაოდენობა აღემატება მიკროსისტემის რაოდენობას, შეუძლებელი იქნება რაოდენობრივი დადგენა, ხოლო თუ ის ძალიან მცირეა, რაოდენობრივი სიზუსტე შემცირდება.

ცრუ პოზიტივი ასევე შეიძლება წარმოიქმნას არასპეციფიკური გაძლიერების დროს.