რეაქციის სისტემის მგრძნობელობის გაზრდა:

1. იზოლირება მაღალი ხარისხის რნმ:

cDNA-ს წარმატებული სინთეზი მოდის მაღალი ხარისხის რნმ-დან.მაღალი ხარისხის რნმ უნდა იყოს მინიმუმ სრული სიგრძე და თავისუფალი ტრანსკრიპტაზის ინჰიბიტორებისგან, როგორიცაა EDTA ან SDS.რნმ-ის ხარისხი განსაზღვრავს თანმიმდევრობის ინფორმაციის მაქსიმალურ რაოდენობას, რომლის გადაწერა შეგიძლიათ cDNA-ში.რნმ-ის გამწმენდის საერთო მეთოდი არის ერთსაფეხურიანი მეთოდი გუანიდინის იზოთიოციანატის/მჟავა ფენოლის გამოყენებით.RNase-ს კვალი რაოდენობით დაბინძურების თავიდან ასაცილებლად, RNase-ით მდიდარი ნიმუშებიდან (როგორიცაა პანკრეასი) იზოლირებული რნმ უნდა ინახებოდეს ფორმალდეჰიდში მაღალი ხარისხის რნმ-ის შესანარჩუნებლად, განსაკუთრებით გრძელვადიანი შენახვისთვის.ვირთხის ღვიძლიდან ამოღებული რნმ ძირითადად იშლებოდა წყალში შენახვის შემდეგ ერთი კვირის განმავლობაში, ხოლო რნმ ამოღებული ვირთხების ელენთადან სტაბილური რჩებოდა წყალში 3 წლის განმავლობაში შენახვის შემდეგ.გარდა ამისა, 4 კბ-ზე მეტი ტრანსკრიპტები უფრო მგრძნობიარეა დეგრადაციის მიმართ კვალი RNase-ებით, ვიდრე მცირე ტრანსკრიპტები.შენახული რნმ-ის ნიმუშების სტაბილურობის გასაზრდელად, რნმ შეიძლება დაიშალოს დეიონიზებულ ფორმამიდში და შეინახოს -70°C-ზე.ფორმამიდი, რომელიც გამოიყენება რნმ-ის შესანარჩუნებლად, უნდა იყოს თავისუფალი რნმ-ის დამშლელი ნარჩენებისგან.პანკრეასის რნმ შეიძლება შენარჩუნდეს ფორმამიდში მინიმუმ ერთი წლის განმავლობაში.რნმ-ის გამოსაყენებლად მომზადებისას შეგიძლიათ გამოიყენოთ შემდეგი მეთოდი რნმ-ის დასალექად: დაამატეთ NaCl 0,2 მ და ეთანოლს 4-ჯერ მეტი მოცულობით, მოათავსეთ ოთახის ტემპერატურაზე 3-5 წუთის განმავლობაში და ცენტრიფუგა 10000×გრ-ზე 5 წუთის განმავლობაში.

2. გამოიყენეთ RNaseH-არააქტიური (RNaseH-) საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა:

RNase ინჰიბიტორები ხშირად ემატება საპირისპირო ტრანსკრიფციის რეაქციებს, რათა გაზარდონ cDNA სინთეზის ხანგრძლივობა და გამოსავალი.RNase ინჰიბიტორები უნდა დაემატოს პირველი ჯაჭვის სინთეზის რეაქციის დროს ბუფერისა და შემცირების აგენტის (როგორიცაა DTT) თანდასწრებით, რადგან cDNA სინთეზამდე პროცესი დენატურებს ახდენს ინჰიბიტორს, რითაც ათავისუფლებს შეკრულ RNase-ს, რომელსაც შეუძლია რნმ-ის დაშლა.პროტეინის RNase ინჰიბიტორები ხელს უშლიან რნმ-ის დეგრადაციას მხოლოდ RNase A, B, C-ით და არ აფერხებენ RNase-ს კანზე, ამიტომ ფრთხილად იყავით, რომ არ შეიყვანოთ RNase თქვენი თითებიდან ამ ინჰიბიტორების გამოყენების მიუხედავად.

საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა კატალიზებს რნმ-ის cDNA-ად გარდაქმნას.ორივე M-MLV და AMV აქვთ ენდოგენური RNaseH აქტივობა, გარდა საკუთარი პოლიმერაზული აქტივობისა.RNaseH აქტივობა და პოლიმერაზას აქტივობა კონკურენციას უწევს ერთმანეთს რნმ შაბლონსა და დნმ-ის პრაიმერს ან cDNA გაფართოების ჯაჭვს შორის წარმოქმნილი ჰიბრიდული ჯაჭვისთვის და ანადგურებს რნმ ჯაჭვს რნმ:დნმ კომპლექსში.RNaseH აქტივობით დეგრადირებული რნმ-ის შაბლონი აღარ შეიძლება იყოს ეფექტური სუბსტრატი cDNA სინთეზისთვის, რაც ამცირებს cDNA სინთეზის ეფექტურობას და ხანგრძლივობას.აქედან გამომდინარე, სასარგებლო იქნება უკუტრანსკრიპტაზას RNaseH აქტივობის აღმოფხვრა ან მნიშვნელოვნად შემცირება.

SuperScript Ⅱ საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა, RNaseH- MMLV საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა და thermoScript საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა, RNaseH- AMV, შეუძლიათ მიიღონ მეტი რაოდენობა და მეტი სრულმეტრაჟიანი cDNA, ვიდრე MMLV და AMV.RT-PCR მგრძნობელობაზე გავლენას მოახდენს cDNA სინთეზის რაოდენობა.ThermoScript ბევრად უფრო მგრძნობიარეა ვიდრე AMV.RT-PCR პროდუქტების ზომა შეზღუდულია საპირისპირო ტრანსკრიპტაზას უნარით სინთეზირდეს cDNA, განსაკუთრებით დიდი cDNA-ების კლონირებისას.MMLV-თან შედარებით, SuperScripⅡ მნიშვნელოვნად გაზარდა ხანგრძლივი RT-PCR პროდუქტების მოსავლიანობა.RNaseH-უკუ ტრანსკრიპტაზას ასევე აქვს გაზრდილი თერმოსტაბილურობა, ამიტომ რეაქცია შეიძლება განხორციელდეს ნორმალურ 37-42°C-ზე მაღალ ტემპერატურაზე.შემოთავაზებული სინთეზის პირობებში გამოიყენეთ ოლიგო(dT) პრაიმერი და 10 μCi [α-P]dCTP.პირველი ჯაჭვის მთლიანი მოსავლიანობა გამოითვალა TCA ნალექების მეთოდის გამოყენებით.სრული სიგრძის cDNA გაანალიზდა ზომით დალაგებული ზოლების გამოყენებით, ამოკვეთილი და დათვლილი ტუტე აგაროზის გელზე.

3. აწიეთ ინკუბაციური ტემპერატურა საპირისპირო ტრანსკრიფციისთვის:

უფრო მაღალი ინკუბაციური ტემპერატურა ხელს უწყობს რნმ-ის მეორადი სტრუქტურის გახსნას, რაც ზრდის რეაქციის ეფექტურობას.რნმ-ის შაბლონების უმეტესობისთვის, რნმ-ის და პრაიმერების ინკუბაცია 65°C-ზე ბუფერისა და მარილის გარეშე, რასაც მოჰყვება ყინულზე სწრაფი გაციება, აღმოფხვრის მეორადი სტრუქტურების უმეტესობას და საშუალებას მისცემს პრაიმერებს შეკვრას.თუმცა, ზოგიერთ შაბლონს ჯერ კიდევ აქვს მეორადი სტრუქტურა, სითბოს დენატურაციის შემდეგაც კი.ამ რთული შაბლონების გაძლიერება შეიძლება განხორციელდეს ThermoScript Reverse Transcriptase-ის გამოყენებით და საპირისპირო ტრანსკრიპციის რეაქციის განთავსება უფრო მაღალ ტემპერატურაზე გაძლიერების გასაუმჯობესებლად.უფრო მაღალმა ინკუბაციურმა ტემპერატურამ ასევე შეიძლება გაზარდოს სპეციფიკა, განსაკუთრებით მაშინ, როდესაც გენსპეციფიკური პრაიმერები (GSP) გამოიყენება cDNA სინთეზისთვის (იხ. თავი 3).თუ იყენებთ GSP-ს, დარწმუნდით, რომ პრაიმერების Tm იგივეა, რაც მოსალოდნელია ინკუბაციური ტემპერატურა.არ გამოიყენოთ ოლიგო(dT) და შემთხვევითი პრაიმერები 60°C-ზე ზემოთ.შემთხვევითი პრაიმერები საჭიროებენ ინკუბაციას 25°C-ზე 10 წუთის განმავლობაში, სანამ არ გაიზრდება 60°C-მდე.გარდა საპირისპირო ტრანსკრიფციის უფრო მაღალი ტემპერატურის გამოყენებისა, სპეციფიკა ასევე შეიძლება გაუმჯობესდეს რნმ/პრაიმერის ნარევის პირდაპირი გადატანით 65°C დენატურაციის ტემპერატურიდან საპირისპირო ტრანსკრიფციის ინკუბაციის ტემპერატურაზე და წინასწარ გახურებული 2× რეაქციის ნარევის დამატებით (cDNA ცხელი დაწყების სინთეზი).ეს მიდგომა ეხმარება თავიდან აიცილოს ინტერმოლეკულური ბაზის დაწყვილება, რომელიც ხდება დაბალ ტემპერატურაზე.RT-PCR-სთვის საჭირო ტემპერატურის მრავალჯერადი გადართვა შეიძლება გამარტივდეს თერმოციკლერის გამოყენებით.

Tth თერმოსტაბილური პოლიმერაზა მოქმედებს როგორც დნმ პოლიმერაზა Mg2+-ის თანდასწრებით და როგორც რნმ პოლიმერაზა Mn2+-ის თანდასწრებით.მისი შენახვა შესაძლებელია თბილად მაქსიმუმ 65°C ტემპერატურაზე.თუმცა, PCR-ის დროს Mn2+-ის არსებობა ამცირებს ერთგულებას, რაც Tth პოლიმერაზას ნაკლებად შესაფერისს ხდის მაღალი სიზუსტის გაძლიერებისთვის, როგორიცაა cDNA-ს კლონირება.გარდა ამისა, Tth-ს აქვს დაბალი საპირისპირო ტრანსკრიფციის ეფექტურობა, რაც ამცირებს მგრძნობელობას და, ვინაიდან საპირისპირო ტრანსკრიფცია და PCR შეიძლება განხორციელდეს ერთი ფერმენტით, საკონტროლო რეაქციები საპირისპირო ტრანსკრიფციის გარეშე არ შეიძლება გამოყენებულ იქნას cDNA-ს გაძლიერების პროდუქტების შესადარებლად გენომიურ დნმ-თან.გამაძლიერებელი პროდუქტები გამოყოფილი იყო.

4. დანამატები, რომლებიც ხელს უწყობენ საპირისპირო ტრანსკრიფციას:

დანამატები, მათ შორის გლიცეროლი და DMSO, ემატება პირველი ჯაჭვის სინთეზის რეაქციას, რამაც შეიძლება შეამციროს ნუკლეინის მჟავას ორჯაჭვიანი სტაბილურობა და გაშალოს რნმ-ის მეორადი სტრუქტურა.20%-მდე გლიცეროლი ან 10% DMSO შეიძლება დაემატოს SuperScript II ან MMLV აქტივობაზე გავლენის გარეშე.AMV ასევე შეუძლია მოითმინოს 20% გლიცეროლი აქტივობის დაკარგვის გარეშე.RT-PCR-ის მგრძნობელობის მაქსიმალური გაზრდის მიზნით SuperScriptⅡ საპირისპირო ტრანსკრიფციის რეაქციაში, შეიძლება დაემატოს 10% გლიცეროლი და ინკუბირებული იყოს 45°C-ზე.თუ საპირისპირო ტრანსკრიფციის რეაქციის პროდუქტის 1/10 ემატება PCR-ს, მაშინ გლიცეროლის კონცენტრაცია ამპლიფიკაციის რეაქციაში არის 0,4%, რაც არ არის საკმარისი PCR-ის დასათრგუნავად.

5. RNaseH მკურნალობა:

cDNA სინთეზის რეაქციების მკურნალობამ RNaseH-ით PCR-მდე შეიძლება გაზარდოს მგრძნობელობა.ზოგიერთი შაბლონისთვის ითვლება, რომ რნმ cDNA სინთეზის რეაქციაში ხელს უშლის ამპლიფიკაციის პროდუქტების შეკავშირებას, ამ შემთხვევაში RNaseH მკურნალობამ შეიძლება გაზარდოს მგრძნობელობა.ზოგადად, RNaseH მკურნალობა აუცილებელია სრულმეტრაჟიანი cDNA სამიზნე შაბლონების გაძლიერებისას, როგორიცაა დაბალი ასლის ტუბეროზული სკეროზი II.ამ რთული შაბლონისთვის, RNaseH მკურნალობამ გააძლიერა SuperScript II-ის ან AMV-ს სინთეზირებული cDNA-ს მიერ წარმოებული სიგნალი.RT-PCR რეაქციების უმეტესობისთვის, RNaseH მკურნალობა არჩევითია, რადგან PCR დენატურაციის საფეხური 95°C-ზე ზოგადად ჰიდროლიზებს რნმ-ს რნმ:დნმ კომპლექსში.

6. მცირე რნმ-ის გამოვლენის მეთოდის გაუმჯობესება:

RT-PCR განსაკუთრებით რთულია, როდესაც რნმ-ის მხოლოდ მცირე რაოდენობაა ხელმისაწვდომი.რნმ-ის იზოლაციის დროს მატარებლის სახით დამატებული გლიკოგენი ხელს უწყობს მცირე ნიმუშების მოსავლიანობის გაზრდას.RNase-ის გარეშე გლიკოგენი შეიძლება დაემატოს ტრიზოლის დამატებით.გლიკოგენი წყალში ხსნადია და მისი შენახვა შესაძლებელია რნმ-თან ერთად წყლის ფაზაში, რათა ხელი შეუწყოს შემდგომ ნალექს.50 მგ-ზე ნაკლები ქსოვილის ან 106 კულტივირებული უჯრედის ნიმუშებისთვის, RNase-ის თავისუფალი გლიკოგენის რეკომენდებული კონცენტრაცია არის 250 მკგ/მლ.

აცეტილირებული BSA-ს საპირისპირო ტრანსკრიფციის რეაქციაში SuperScript II-ის გამოყენებით შეიძლება გაზარდოს მგრძნობელობა, ხოლო რნმ-ის მცირე რაოდენობით, SuperScript II-ის რაოდენობის შემცირება და 40 ერთეული RNaseOut ნუკლეაზას ინჰიბიტორის დამატება შეიძლება გაზარდოს გამოვლენის დონე.თუ გლიკოგენი გამოიყენება რნმ-ის იზოლაციის პროცესში, მაინც რეკომენდებულია BSA ან RNase ინჰიბიტორის დამატება SuperScript II-ის გამოყენებისას საპირისპირო ტრანსკრიფციის რეაქციისთვის.

მაგალითად, RT-PCR სპეციფიკის გაზრდა

1. CND ასინთეზა:

პირველი ჯაჭვის cDNA სინთეზის დაწყება შესაძლებელია სამი განსხვავებული მეთოდის გამოყენებით, რომელთა შედარებითი სპეციფიკა გავლენას ახდენს სინთეზირებული cDNA-ს რაოდენობასა და ტიპზე.

შემთხვევითი პრაიმერის მეთოდი იყო ყველაზე ნაკლებად სპეციფიკური სამი მეთოდიდან.პრაიმერები ანელებენ მრავალ ადგილას ტრანსკრიპტის მასშტაბით, წარმოქმნიან მოკლე, ნაწილობრივი სიგრძის cDNA-ებს.ეს მეთოდი ხშირად გამოიყენება 5' ბოლო თანმიმდევრობების მისაღებად და cDNA-ს მისაღებად რნმ-ის შაბლონებიდან მეორადი სტრუქტურის რეგიონებით ან ტერმინალის უბნებით, რომლებიც არ შეიძლება განმეორდეს საპირისპირო ტრანსკრიპტაზათ.ყველაზე გრძელი cDNA-ს მისაღებად, პრაიმერების და რნმ-ის თანაფარდობა რნმ-ის თითოეულ ნიმუშში ემპირიულად უნდა განისაზღვროს.შემთხვევითი პრაიმერების საწყისი კონცენტრაცია მერყეობდა 50-დან 250 ნგამდე 20 μl რეაქციაზე.ვინაიდან cDNA სინთეზირებული მთლიანი რნმ-დან შემთხვევითი პრაიმერების გამოყენებით არის ძირითადად რიბოსომური რნმ, პოლი(A)+რნმ ძირითადად არჩეულია შაბლონად.

ოლიგო(dT) პრაიმერები უფრო სპეციფიკურია ვიდრე შემთხვევითი პრაიმერები.ის ჰიბრიდდება პოლი(A) კუდთან, რომელიც გვხვდება ევკარიოტული mRNA-ების უმეტესობის 3' ბოლოში.იმის გამო, რომ პოლი(A)+ რნმ შეადგენს მთლიანი რნმ-ის დაახლოებით 1%-2%-ს, cDNA-ს რაოდენობა და სირთულე გაცილებით ნაკლებია, ვიდრე შემთხვევითი პრაიმერების შემთხვევაში.მისი მაღალი სპეციფიკის გამო, ოლიგო(dT) ზოგადად არ საჭიროებს რნმ-ის პრაიმერებთან თანაფარდობის ოპტიმიზაციას და პოლი(A)+ შერჩევას.რეკომენდირებულია 0,5მკგ ოლიგო(dT) გამოყენება 20მკლ რეაქციის სისტემაზე.oligo(dT)12-18 შესაფერისია RT-PCR უმეტესობისთვის.ThermoScript RT-PCR სისტემა გთავაზობთ oligo(dT)20-ს უკეთესი თერმული სტაბილურობის გამო უფრო მაღალი ინკუბაციური ტემპერატურისთვის.

გენის სპეციფიკური პრაიმერები (GSP) არის ყველაზე სპეციფიკური პრაიმერები საპირისპირო ტრანსკრიფციის საფეხურზე.GSP არის ანტიმგრძნობიარე ოლიგონუკლეოტიდი, რომელსაც შეუძლია სპეციალურად ჰიბრიდიზაცია მოახდინოს რნმ-ის სამიზნე თანმიმდევრობასთან, შემთხვევითი პრაიმერებისგან ან ოლიგო(dT)გან განსხვავებით, რომლებიც ახდენენ ყველა რნმ-ს.იგივე წესები, რომლებიც გამოიყენება PCR პრაიმერების შესაქმნელად, გამოიყენება GSP-ის დიზაინზე საპირისპირო ტრანსკრიფციის რეაქციებში.GSP შეიძლება იყოს იგივე თანმიმდევრობა, როგორც გამაძლიერებელი პრაიმერი, რომელიც ანელებს mRNA-ს 3'-უმეტეს ბოლო ბოლოში, ან GSP შეიძლება იყოს შემუშავებული საპირისპირო გამაძლიერებელი პრაიმერის ქვემოთ ანეილისთვის.ზოგიერთი გაძლიერებული სუბიექტისთვის, ერთზე მეტი ანტისენსიური პრაიმერი უნდა იყოს შემუშავებული წარმატებული RT-PCR-სთვის, რადგან სამიზნე რნმ-ის მეორადი სტრუქტურამ შეიძლება ხელი შეუშალოს პრაიმერის შეკავშირებას.რეკომენდირებულია გამოიყენოს 1 pmol ანტისენსიური GSP 20 μl პირველი ჯაჭვის სინთეზის რეაქციაში.

2. აწიეთ ინკუბაციური ტემპერატურა საპირისპირო ტრანსკრიფციისთვის:

იმისათვის, რომ სრულად გამოვიყენოთ GSP სპეციფიკის სრული უპირატესობები, უნდა იქნას გამოყენებული საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა უმაღლესი თერმდგრადობით.თერმოსტაბილური საპირისპირო ტრანსკრიპტაზები შეიძლება ინკუბირებული იყოს მაღალ ტემპერატურაზე, რათა გაიზარდოს რეაქციის სიმკაცრე.მაგალითად, თუ GSP ადუღდება 55°C-ზე, GSP-ის სპეციფიკა სრულად არ იქნება გამოყენებული, თუ AMV ან M-MLV გამოიყენება საპირისპირო ტრანსკრიფციისთვის დაბალ სიმკაცრეზე 37°C.თუმცა, SuperScript II-ისა და ThermoScript-ის რეაქცია შესაძლებელია 50°C ან უფრო მაღალ ტემპერატურაზე, რაც აღმოფხვრის დაბალ ტემპერატურაზე წარმოქმნილ არასპეციფიკურ პროდუქტებს.მაქსიმალური სპეციფიკისთვის, რნმ/პრაიმერის ნარევი შეიძლება გადავიდეს პირდაპირ 65°C დენატურაციის ტემპერატურიდან საპირისპირო ტრანსკრიფციის ინკუბაციურ ტემპერატურაზე და დაემატოს წინასწარ გახურებულ 2× რეაქციის ნარევს (cDNA სინთეზის ცხელი დაწყება).ეს ეხმარება თავიდან აიცილოს ინტერმოლეკულური ბაზის დაწყვილება დაბალ ტემპერატურაზე.RT-PCR-სთვის საჭირო ტემპერატურის მრავალჯერადი გადასვლა შეიძლება გამარტივდეს თერმოციკლერის გამოყენებით.

3. ამცირებს გენომიურ დნმ-ის დაბინძურებას:

პოტენციური სირთულე, რომელსაც აწყდება RT-PCR, არის გენომიური დნმ-ის დაბინძურება რნმ-ში.რნმ-ის იზოლაციის კარგი მეთოდის გამოყენება, როგორიცაა ტრიზოლის რეაგენტი, შეამცირებს გენომიური დნმ-ის რაოდენობას, რომელიც აბინძურებს რნმ-ს პრეპარატს.გენომიური დნმ-ისგან მიღებული პროდუქტების თავიდან ასაცილებლად, რნმ შეიძლება დამუშავდეს გამაძლიერებელი ხარისხის DNase I-ით, რათა ამოიღონ დამაბინძურებელი დნმ-ის საპირისპირო ტრანსკრიფციამდე.DNase I მონელება შეწყდა ნიმუშების ინკუბაციით 2.0 მმ EDTA-ში 10 წუთის განმავლობაში 65°C-ზე.EDTA-ს შეუძლია მაგნიუმის იონების შელატება, რაც ხელს უშლის მაგნიუმის იონზე დამოკიდებული რნმ-ის ჰიდროლიზს მაღალ ტემპერატურაზე.

გაძლიერებული cDNA გენომიური დნმ-ის ამპლიფიკაციის პროდუქტებისგან გამიჯვნის მიზნით, პრაიმერები შეიძლება შეიქმნას, რომ თითოეული ანეიროს ეგზონებზე.cDNA-დან მიღებული PCR პროდუქტები უფრო მოკლე იქნება, ვიდრე დაბინძურებული გენომიური დნმ-ისგან მიღებული პროდუქტები.გარდა ამისა, საკონტროლო ექსპერიმენტი საპირისპირო ტრანსკრიფციის გარეშე ჩატარდა რნმ-ის თითოეულ შაბლონზე იმის დასადგენად, იყო თუ არა მოცემული ფრაგმენტი გენომიური დნმ-დან ან cDNA-დან მიღებული.საპირისპირო ტრანსკრიფციის გარეშე მიღებული PCR პროდუქტი მიღებულია გენომიდან.