1. საბაზისო ცოდნა (თუ გსურთ ექსპერიმენტული ნაწილის ნახვა, გადაიტანეთ პირდაპირ მეორე ნაწილზე)
როგორც ჩვეულებრივი PCR-ის წარმოებული რეაქცია, რეალურ დროში PCR ძირითადად აკონტროლებს გამაძლიერებელი პროდუქტის რაოდენობის ცვლილებას PCR გამაძლიერებელი რეაქციის თითოეულ ციკლში რეალურ დროში ფლუორესცენციის სიგნალის ცვლილების გზით და რაოდენობრივად აანალიზებს საწყისი შაბლონს ct მნიშვნელობასა და სტანდარტულ მრუდს შორის ურთიერთობის მეშვეობით.
RT-PCR-ის სპეციფიკური მონაცემებიასაბაზისო, ფლუორესცენციის ბარიერიდაCt მნიშვნელობა.
| საბაზისო: | მე-3-15 ციკლის ფლუორესცენტური მნიშვნელობა არის საბაზისო (საბაზისო), რომელიც გამოწვეულია გაზომვის შემთხვევითი შეცდომით. |
| ბარიერი (ბარიერი): | იგულისხმება ფლუორესცენციის გამოვლენის ლიმიტი, რომელიც დაყენებულია შესაბამის პოზიციაზე ამპლიფიკაციის მრუდის ექსპონენციალური ზრდის რეგიონში, ძირითადად 10-ჯერ აღემატება საბაზისო სტანდარტულ გადახრას. |
| CT მნიშვნელობა: | ეს არის PCR ციკლების რაოდენობა, როდესაც ფლუორესცენციის მნიშვნელობა თითოეულ რეაქციის მილში აღწევს ზღურბლს. Ct მნიშვნელობა უკუპროპორციულია საწყისი შაბლონის რაოდენობასთან. |
RT-PCR-ის მარკირების საერთო მეთოდები:
| მეთოდი | უპირატესობა | ნაკლოვანება | გამოყენების სფერო |
| SYBR GreenⅠ | ფართო გამოყენებადობა, მგრძნობიარე, იაფი და მოსახერხებელი | პრაიმერის მოთხოვნები მაღალია, მიდრეკილია არასპეციფიკური ზოლების მიმართ | იგი შესაფერისია სხვადასხვა სამიზნე გენების რაოდენობრივი ანალიზისთვის, გენის ექსპრესიის კვლევისთვის და ტრანსგენური რეკომბინანტული ცხოველებისა და მცენარეების კვლევისთვის. |
| TaqMan | კარგი სპეციფიკა და მაღალი განმეორებადობა | ფასი მაღალია და მხოლოდ კონკრეტული მიზნებისთვისაა შესაფერისი. | პათოგენის გამოვლენა, წამლისმიერი რეზისტენტობის გენის კვლევა, წამლის ეფექტურობის შეფასება, გენეტიკური დაავადებების დიაგნოსტიკა. |
| მოლეკულური შუქურა | მაღალი სპეციფიკა, ფლუორესცენცია, დაბალი ფონი | ფასი მაღალია, მხოლოდ კონკრეტული მიზნისთვისაა შესაფერისი, დიზაინი რთულია, ფასი კი მაღალი. | სპეციფიკური გენის ანალიზი, SNP ანალიზი |
2. ექსპერიმენტული საფეხურები
2.1 ექსპერიმენტული დაჯგუფების შესახებ- ჯგუფში უნდა იყოს რამდენიმე ჭაბურღილი და უნდა იყოს ბიოლოგიური გამეორებები.
| ① | ცარიელი კონტროლი | გამოიყენება ექსპერიმენტებში უჯრედების ზრდის სტატუსის დასადგენად |
| ② | უარყოფითი საკონტროლო siRNA (არასპეციფიკური siRNA თანმიმდევრობა) | რნმ-ის მოქმედების სპეციფიკის დემონსტრირება.siRNA-მ შეიძლება გამოიწვიოს სტრესის არასპეციფიკური პასუხი 200 ნმ კონცენტრაციით. |
| ③ | ტრანსფექციის რეაგენტის კონტროლი | გამორიცხეთ ტრანსფექციის რეაგენტის ტოქსიკურობა უჯრედებზე ან გავლენა სამიზნე გენის ექსპრესიაზე |
| ④ | siRNA სამიზნე გენის წინააღმდეგ | დაანგრიეთ სამიზნე გენის გამოხატულება |
| ⑤ (სურვილისამებრ) | დადებითი siRNA | გამოიყენება ექსპერიმენტული სისტემის და ოპერაციული პრობლემების მოსაგვარებლად |
| ⑥ (სურვილისამებრ) | ფლუორესცენტური კონტროლი siRNA | უჯრედის ტრანსფექციის ეფექტურობის დაკვირვება შესაძლებელია მიკროსკოპით |
2.2 პრაიმერის დიზაინის პრინციპები
| გაძლიერებული ფრაგმენტის ზომა | სასურველია 100-150bp |
| პრაიმერის სიგრძე | 18-25bp |
| GC შინაარსი | 30%-70%, სასურველია 45%-55% |
| Tm მნიშვნელობა | 58-60℃ |
| თანმიმდევრობა | მოერიდეთ უწყვეტ T/C-ს;A/G უწყვეტი |
| მე -3 ბოლო თანმიმდევრობა | მოერიდეთ GC rich ან AT rich;ტერმინალური ბაზა სასურველია G ან C;უმჯობესია თავიდან აიცილოთ T |
| კომპლემენტარულობა | მოერიდეთ 3-ზე მეტი ფუძის დამატებით თანმიმდევრობას პრაიმერის შიგნით ან ორ პრაიმერს შორის |
| სპეციფიკა | გამოიყენეთ აფეთქების ძებნა პრაიმერის სპეციფიკის დასადასტურებლად |
①SiRNA არის სახეობის სპეციფიკური და სხვადასხვა სახეობის თანმიმდევრობა განსხვავებული იქნება.
②SiRNA შეფუთულია ყინვაში გამხმარ ფხვნილში, რომელიც შეიძლება სტაბილურად ინახებოდეს 2-4 კვირის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე.
2.3 ხელსაწყოები ან რეაგენტები, რომლებიც წინასწარ უნდა მომზადდეს
| პრაიმერი (შიდა მითითება) | მათ შორის ორი წინ და უკან |
| პრაიმერები (სამიზნე გენი) | მათ შორის ორი წინ და უკან |
| სამიზნე Si RNA (3 ზოლი) | ზოგადად, კომპანია ასინთეზებს 3 ზოლს და შემდეგ აირჩევს სამიდან ერთს RT-PCR-ით. |
| ტრანსფექციის ნაკრები | Lipo2000 და ა.შ. |
| რნმ სწრაფი ექსტრაქციის ნაკრები | ტრანსფექციის შემდეგ რნმ-ის ექსტრაქციისთვის |
| სწრაფი უკუ ტრანსკრიფციის ნაკრები | cDNA სინთეზისთვის |
| PCR გამაძლიერებელი ნაკრები | 2×სუპერ SYBR მწვანე qPCR მასტერ მიქსი |
2.4 იმ საკითხებთან დაკავშირებით, რომლებსაც ყურადღება უნდა მიექცეს კონკრეტულ ექსპერიმენტულ საფეხურებში:
①siRNA ტრანსფექციის პროცესი
1. პლასტირებისთვის შეგიძლიათ აირჩიოთ 24 ჭაბურღილის ფირფიტა, 12 ჭაბურღილი ან 6 ჭაბურღილის ფირფიტა (24 ჭაბურღილის ფირფიტის თითოეულ ჭაბურღილში შემოთავაზებული საშუალო რნმ-ის კონცენტრაცია დაახლოებით 100-300 ნგ/მლ) და უჯრედების ტრანსფექციის ოპტიმალური სიმკვრივეა 60%-80% ან მეტი.
2. ტრანსფექციის საფეხურები და სპეციფიკური მოთხოვნები მკაცრად შეესაბამება ინსტრუქციას.
3. ტრანსფექციის შემდეგ, ნიმუშები შეიძლება შეგროვდეს 24-72 საათის განმავლობაში mRNA-ს გამოვლენისთვის (RT-PCR) ან ცილის გამოვლენისთვის 48-96 საათის განმავლობაში (WB)
② რნმ-ის ექსტრაქციის პროცესი
1. თავიდან აიცილოთ დაბინძურება ეგზოგენური ფერმენტებით.იგი ძირითადად მოიცავს ნიღბებისა და ხელთათმანების მკაცრად ტარებას;სტერილიზებული პიპეტის წვერების და EP მილების გამოყენებით;ექსპერიმენტში გამოყენებული წყალი უნდა იყოს RNase-ის გარეშე.
2. რეკომენდებულია სწრაფი ექსტრაქციის კომპლექტში შემოთავაზებული ორჯერ გაკეთება, რაც ნამდვილად გააუმჯობესებს სისუფთავეს და მოსავლიანობას.
3. ნარჩენი სითხე არ უნდა შეეხოს რნმ სვეტს.
③ რნმ-ის რაოდენობრივი განსაზღვრა
რნმ-ის ამოღების შემდეგ, მისი რაოდენობრივი დადგენა შესაძლებელია პირდაპირ Nanodrop-ით და მინიმალური მაჩვენებელი შეიძლება იყოს 10ng/ul-მდე.
④ საპირისპირო ტრანსკრიფციის პროცესი
1. RT-qPCR-ის მაღალი მგრძნობელობის გამო, მინიმუმ 3 პარალელური ჭაბურღილი უნდა გაკეთდეს თითოეული ნიმუშისთვის, რათა თავიდან იქნას აცილებული შემდგომი Ct არ იყოს ძალიან განსხვავებული ან SD იყოს ძალიან დიდი სტატისტიკური ანალიზისთვის.
2. არ გაყინოთ და გალღოთ Master mix განმეორებით.
3. თითოეული მილი/ხვრელი უნდა შეიცვალოს ახალი წვერით!ნუ გამოიყენებთ მუდმივად ერთი და იგივე პიპეტის წვერი ნიმუშების დასამატებლად!
4. ნიმუშის დამატების შემდეგ 96 ჭაბურღილის ფირფიტაზე დამაგრებული ფილმი საჭიროა დაფქვა ფირფიტით.უმჯობესია მოაწყოთ ცენტრიფუგა მანქანაზე დაყენებამდე, რათა მილის კედელზე არსებული სითხე ქვევით ჩამოვიდეს და ამოიღონ ჰაერის ბუშტები.
⑤საერთო მრუდის ანალიზი
| ლოგარითმული ზრდის პერიოდი არ არის | შაბლონის შესაძლოა მაღალი კონცენტრაცია |
| არ არის CT მნიშვნელობა | ფლუორესცენტური სიგნალების გამოვლენის არასწორი ნაბიჯები; პრაიმერების ან ზონდების დეგრადაცია - მისი მთლიანობის დადგენა შესაძლებელია PAGE ელექტროფორეზით; შაბლონის არასაკმარისი რაოდენობა; შაბლონების დეგრადაცია - მინარევების შეყვანის თავიდან აცილება და განმეორებითი გაყინვა და დათბობა ნიმუშის მომზადებაში; |
| Ct>38 | დაბალი გამაძლიერებელი ეფექტურობა;PCR პროდუქტი ძალიან გრძელია;სხვადასხვა რეაქციის კომპონენტები იშლება |
| ხაზოვანი გაძლიერების მრუდი | ზონდები შეიძლება ნაწილობრივ დაზიანდეს გაყინვა-დათბობის განმეორებითი ციკლების ან სინათლის გახანგრძლივებული ზემოქმედების შედეგად. |
| განსხვავება დუბლიკატ ხვრელებს შორის განსაკუთრებით დიდია | რეაქციის ხსნარი ბოლომდე არ არის დამდნარი ან რეაქციის ხსნარი არ არის შერეული;PCR ინსტრუმენტის თერმული აბაზანა დაბინძურებულია ფლუორესცენტური ნივთიერებებით |
2.5 მონაცემთა ანალიზის შესახებ
qPCR-ის მონაცემთა ანალიზი შეიძლება დაიყოს ფარდობით რაოდენობრივ და აბსოლუტურ რაოდენობებად.მაგალითად, უჯრედები სამკურნალო ჯგუფში საკონტროლო ჯგუფის უჯრედებთან შედარებით,
რამდენჯერ იცვლება X გენის mRNA, ეს ფარდობითი რაოდენობრივი მაჩვენებელია;უჯრედების გარკვეულ რაოდენობაში, X გენის mRNA
რამდენი ეგზემპლარი არსებობს, ეს აბსოლუტური რაოდენობრივი მაჩვენებელია.ჩვეულებრივ, რასაც ყველაზე მეტად ვიყენებთ ლაბორატორიაში, არის შედარებითი რაოდენობრივი მეთოდი.ჩვეულებრივ,2-ΔΔct მეთოდიყველაზე მეტად გამოიყენება ექსპერიმენტებში, ამიტომ აქ დეტალურად მხოლოდ ეს მეთოდი იქნება გაცნობილი.
2-ΔΔct მეთოდი: მიღებული შედეგია ექსპერიმენტულ ჯგუფში სამიზნე გენის ექსპრესიის განსხვავება საკონტროლო ჯგუფის სამიზნე გენთან მიმართებაში.საჭიროა, რომ როგორც სამიზნე გენის, ასევე შიდა საცნობარო გენის ამპლიფიკაციის ეფექტურობა იყოს 100%-მდე, ხოლო ფარდობითი გადახრა არ უნდა აღემატებოდეს 5%-ს.
გაანგარიშების მეთოდი შემდეგია:
Δct საკონტროლო ჯგუფი = სამიზნე გენის ct მნიშვნელობა საკონტროლო ჯგუფში – შიდა საცნობარო გენის ct მნიშვნელობა საკონტროლო ჯგუფში
Δct ექსპერიმენტული ჯგუფი = სამიზნე გენის ct მნიშვნელობა ექსპერიმენტულ ჯგუფში – შიდა საცნობარო გენის ct მნიშვნელობა ექსპერიმენტულ ჯგუფში
ΔΔct=Δct ექსპერიმენტული ჯგუფი-Δct საკონტროლო ჯგუფი
დაბოლოს, გამოთვალეთ გამოხატვის დონის სხვაობის ჯერადი:
შეცვალეთ Fold=2-ΔΔct (ექსელის ფუნქციის შესაბამისი არის POWER)
Მსგავსი პროდუქტები:
გამოქვეყნების დრო: მაისი-20-2023
