რეალურ დროში PCR, ასევე ცნობილი როგორც რაოდენობრივი PCR ან qPCR, არის მეთოდი PCR გამაძლიერებელი პროდუქტების რეალურ დროში მონიტორინგისა და ანალიზისთვის.
იმის გამო, რომ რაოდენობრივ PCR-ს აქვს მარტივი ოპერაცია, სწრაფი და მოსახერხებელი, მაღალი მგრძნობელობა, კარგი განმეორებადობა და დაბალი დაბინძურების სიხშირე, იგი ფართოდ გამოიყენება სამედიცინო ტესტებში, წამლების ეფექტურობის შეფასებაში, გენის ექსპრესიის კვლევაში, ტრანსგენურ კვლევაში, გენის გამოვლენაში, პათოგენის გამოვლენაში, ცხოველთა და მცენარეთა გამოვლენაში., საკვების ტესტირება და სხვა სფეროები.
ამიტომ, ხართ თუ არა ჩართული საბაზისო კვლევებით ცხოვრების მეცნიერებებში, თუ ფარმაცევტული კომპანიების, მეცხოველეობის კომპანიების, კვების კომპანიების, ან თუნდაც შესვლა-გასვლის ინსპექტირებისა და საკარანტინო ბიუროების, გარემოს მონიტორინგის განყოფილებების, საავადმყოფოების და სხვა განყოფილებების თანამშრომლები, მეტ-ნაკლებად იქნებით გამოვლენილი.

რეალურ დროში PCR-ის პრინციპი

რეალურ დროში PCR არის მეთოდი, რომლის დროსაც ფლუორესცენტური ნივთიერებები ემატება PCR რეაქციის სისტემას და ფლუორესცენტური სიგნალის ინტენსივობა PCR რეაქციის პროცესში მონიტორინგდება რეალურ დროში რაოდენობრივი PCR ინსტრუმენტის საშუალებით და საბოლოოდ ხდება ექსპერიმენტული მონაცემების ანალიზი და დამუშავება.

【გაძლიერების მრუდი】არის მრუდი, რომელიც აღწერს PCR-ის დინამიურ პროცესს.PCR-ის ამპლიფიკაციის მრუდი სინამდვილეში არ არის სტანდარტული ექსპონენციალური მრუდი, არამედ სიგმოიდური მრუდი.

[ამპლიფიკაციის მრუდის პლატფორმის ფაზა]PCR ციკლების რაოდენობის მატებასთან ერთად, დნმ პოლიმერაზას ინაქტივაცია, dNTP-ების და პრაიმერების დაქვეითება და რეაქციის სუბპროდუქტის პიროფოსფატის მიერ სინთეზის რეაქციის ინჰიბირება და ა.შ., PCR ყოველთვის არ ფართოვდება ექსპონენტურად., და საბოლოოდ შევა პლატოზე.

[გაძლიერების მრუდის ექსპონენციალური ზრდის რეგიონი]მიუხედავად იმისა, რომ პლატოს ფაზა მნიშვნელოვნად განსხვავდება, ამპლიფიკაციის მრუდის ექსპონენციალური ზრდის რეგიონის გარკვეულ რეგიონში, განმეორებადობა ძალიან კარგია, რაც ძალიან მნიშვნელოვანია PCR-ის რაოდენობრივი ანალიზისთვის.

[ზღურბლის მნიშვნელობა და Ct მნიშვნელობა]ჩვენ ვაყენებთ ფლუორესცენციის გამოვლენის ზღვრულ მნიშვნელობას შესაბამის პოზიციაზე ამპლიფიკაციის მრუდის ექსპონენციალური ზრდის არეში, კერძოდ, ზღურბლის მნიშვნელობაზე (Threshold).ზღვრული მნიშვნელობისა და გაძლიერების მრუდის კვეთა არის Ct მნიშვნელობა, ანუ Ct მნიშვნელობა ეხება ციკლების რაოდენობას (Threshold Cycle), როდესაც ზღვრული მნიშვნელობა მიიღწევა.

ქვემოთ მოყვანილი გრაფიკი ნათლად გვიჩვენებს ურთიერთობას ზღურბლის ხაზსა და გაძლიერების მრუდს, ზღურბლსა და Ct მნიშვნელობას შორის.

【როგორ გავზომოთ რაოდენობები?】

მათემატიკური თეორიით დადასტურდა, რომ Ct მნიშვნელობას აქვს შებრუნებული წრფივი კავშირი საწყისი შაბლონების რაოდენობის ლოგარითმთან.Real Time PCR აკონტროლებს PCR გამაძლიერებელი პროდუქტების რეალურ დროში და რაოდენობრივად განსაზღვრავს მათ ექსპონენციალური გაძლიერების ფაზაში.

PCR-ის ყოველი ციკლისთვის დნმ ექსპონენციალურად გაიზარდა 2-ჯერ და მალე მიაღწია პლატოს.

ვივარაუდოთ, რომ საწყისი დნმ-ის რაოდენობა არის A₀ n ციკლის შემდეგ, დნმ პროდუქტის თეორიული რაოდენობა შეიძლება გამოიხატოს როგორც:

A _n =A ₀ × 2ⁿ

შემდეგ, რაც უფრო მეტია დნმ-ის საწყისი რაოდენობა A 0, მით უფრო ადრე გაძლიერებული პროდუქტის რაოდენობა მიაღწევს აღმოჩენის მნიშვნელობას An , და ციკლების რაოდენობა An-ის მიღწევისას არის Ct მნიშვნელობა.ანუ რაც უფრო მეტია დნმ-ის საწყისი რაოდენობა A 0, მით უფრო ადრე აღწევს ამპლიფიკაციის მრუდი პიკს და შესაბამისად n ციკლების საჭირო რაოდენობა ნაკლებია.

ჩვენ ვახორციელებთ ცნობილი კონცენტრაციის სტანდარტის გრადიენტულ განზავებას და ვიყენებთ მას, როგორც შაბლონს რეალურ დროში PCR-სთვის, და მიიღება გამაძლიერებელი მრუდების სერია თანაბარი ინტერვალებით, დნმ-ის საწყისი რაოდენობის თანმიმდევრობით მეტიდან ნაკლებიდან.Ct მნიშვნელობასა და საწყისი შაბლონების რაოდენობის ლოგარითმის წრფივი დამოკიდებულების მიხედვით, ა.[სტანდარტული მრუდი] შეიძლება შეიქმნას.

უცნობი კონცენტრაციით ნიმუშის Ct მნიშვნელობის სტანდარტულ მრუდში ჩანაცვლებით, შეიძლება მივიღოთ უცნობი კონცენტრაციის ნიმუშის საწყისი შაბლონის რაოდენობა, რაც არის Real Time PCR-ის რაოდენობრივი პრინციპი.

რეალურ დროში PCR-ის გამოვლენის მეთოდი

რეალურ დროში PCR აღმოაჩენს PCR გაძლიერების პროდუქტებს რეაქციის სისტემაში ფლუორესცენციის ინტენსივობის გამოვლენით.

ფლუორესცენტური საღებავის ჩანერგვის მეთოდის პრინციპი】

ფლუორესცენტური საღებავები, როგორიცაა TB Green ® , შეუძლია არასპეციფიკურად დაუკავშირდეს ორჯაჭვიან დნმ-ს PCR სისტემებში და ფლუორესციონირება შებოჭვისას.

ფლუორესცენციის ინტენსივობა რეაქციის სისტემაში ექსპონენტურად გაიზარდა PCR ციკლების მატებასთან ერთად.ფლუორესცენციის ინტენსივობის გამოვლენით, რეაქციის სისტემაში დნმ-ის გაძლიერების ოდენობის მონიტორინგი შესაძლებელია რეალურ დროში, შემდეგ კი ნიმუშში საწყისი შაბლონის რაოდენობა შეიძლება საპირისპიროდ შეფასდეს.

【ფლუორესცენტური ზონდის მეთოდის პრინციპი】

ფლუორესცენტური ზონდიარის ნუკლეინის მჟავების თანმიმდევრობა, რომელსაც აქვს ფლუორესცენტური ჯგუფი 5′ ბოლოზე და ჩამქრალი ჯგუფი 3′ ბოლოზე, რომელსაც შეუძლია კონკრეტულად მიბმა შაბლონთან.როდესაც ზონდი ხელუხლებელია, ფლუოროფორის მიერ გამოსხივებული ფლუორესცენცია ჩაქრება ჩამქრალი ჯგუფის მიერ და არ შეუძლია ფლუორესცირება.როდესაც ზონდი იშლება, ფლუორესცენტური ნივთიერება დაიშლება და გამოყოფს ფლუორესცენციას.

ფლუორესცენტური ზონდი ემატება PCR რეაქციის ხსნარს.ანეილირების პროცესში, ფლუორესცენტური ზონდი უკავშირდება შაბლონის კონკრეტულ პოზიციას.გაფართოების პროცესში, PCR ფერმენტის 5'→3' ეგზონუკლეაზას აქტივობამ შეიძლება დაშალოს შაბლონთან ჰიბრიდირებული ფლუორესცენტური ზონდი და ფლუორესცენტური ნივთიერება დისოცირდება ფლუორესცენციის გამოსაცემად.რეაქციის სისტემაში ზონდის ფლუორესცენციის ინტენსივობის გამოვლენით, PCR პროდუქტის ამპლიფიკაციის ოდენობის მონიტორინგის მიზნის მიღწევა შესაძლებელია.

【ფლუორესცენციის გამოვლენის მეთოდის შერჩევა】

თუ იგი გამოიყენება მაღალი ჰომოლოგიის თანმიმდევრობების გასარჩევად და მულტიპლექსური PCR გამოვლენის შესასრულებლად, როგორიცაა SNP ტიპის ანალიზი, ფლუორესცენტური ზონდის მეთოდი შეუცვლელია.
სხვა რეალურ დროში PCR ექსპერიმენტებისთვის შეიძლება გამოყენებულ იქნას მარტივი, მარტივი და იაფი ფლუორესცენტური ქიმერის მეთოდი.

probesძლიერი სპეციფიკა, რომელსაც შეუძლია მულტიპლექს PCR

ნაკლოვანება

მაღალი სპეციფიკის მოთხოვნები ამპლიფიკაციისთვის;

მულტიპლექსური PCR არ შეიძლება შესრულდეს, საჭიროა კონკრეტული ზონდების დაპროექტება, მაღალი ღირებულება;

ზოგჯერ ზონდის დიზაინი რთულია

Მსგავსი პროდუქტები: