RT-qPCR არის მოლეკულური ბიოლოგიის ძირითადი ექსპერიმენტი და ყველამ უნდა იცნობდეს მას.იგი ძირითადად მოიცავს სამ საფეხურს: რნმ-ის ექსტრაქციას, საპირისპირო ტრანსკრიფციას cDNA-ში და რეალურ დროში ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR.არ შველის, რა ხდება?სავარაუდოა, რომ პრობლემაასაპირისპირო ტრანსკრიფციის ექსპერიმენტი!თუმცა, როგორც ჩანს, საპირისპირო ტრანსკრიფციის ექსპერიმენტს მხოლოდ რნმ, dNTP, პრაიმერები დასაპირისპირო ტრანსკრიპტაზაცენტრიფუგის მილზე და კარგად აურიეთ, მაგრამ რეალურად მუშაობის პროცესში ჯერ კიდევ ბევრი დეტალია, რომელსაც ყურადღება უნდა მიექცეს.მოდით ვისწავლოთ ამის შესახებ!

როგორ ვიმსჯელოთ რნმ-ის ხარისხზე?
cDNA-ს მისაღებად რნმ-ის ხარისხი გადამწყვეტია!რნმ-ის ხარისხი შეიძლება გამოვლინდეს ძირითადად ორი ასპექტიდან:
(1) რნმ მთლიანობა:რნმ მთლიანობის შემოწმება შესაძლებელია აგაროზის გელის ელექტროფორეზით. ევკარიოტების მაგალითით, მთლიან მთლიან რნმ-ს აქვს სამი მკაფიო ზოლი, მოლეკულური წონა დიდიდან პატარამდე არის 28S, 18S და 5S, ხოლო 28S ორჯერ უფრო კაშკაშაა ვიდრე 18S;თუ სამი ზოლი ჩანს, მაგრამ ზოლის ტიპი ბუნდოვანია ან დიფუზია ნიშნავს, რომ რნმ ნაწილობრივ დეგრადირებულია.ამ დროს, გთხოვთ, დაუყოვნებლივ შეასრულოთ საპირისპირო ტრანსკრიფციის რეაქცია და გაზარდოთ შაბლონის შეყვანა სათანადოდ;თუ მხოლოდ მცირე მოლეკულური წონის ზოლი ჩანს, რნმ მთლიანად დაიშალა და ხელახლა ექსტრაქციაა საჭირო.Agilent 2100 მიუთითებს რნმ-ის მთლიანობაზე პიკური დიაგრამით და RIN მნიშვნელობით.თუ ნუკლეინის მჟავა ხელუხლებელია, ელექტროფეროგრამის საწყისი ხაზი ბრტყელია;თუ ნუკლეინის მჟავა ძლიერ დეგრადირებულია, საბაზისო დონე არათანაბარია და უფრო მეტი დეგრადაციის მწვერვალი ჩნდება;RIN-ის მნიშვნელობა ასახავს რნმ-ის მთლიანობას, 0-10 დიაპაზონში, რაც უფრო დიდია მნიშვნელობა, მით უკეთესია რნმ-ის ხარისხი.ისე, რაც უფრო მაღალია სისრულის ხარისხი.
(2) რნმ-ის სისუფთავე:OD260/280 თანაფარდობა შეიძლება გამოვლინდეს UV სპექტროფოტომეტრიით.თუ OD260/280-ის თანაფარდობა არის 1.9-დან 2.1-მდე, სისუფთავე ძალიან კარგია.
ნარჩენი გენომის დნმ შეიძლება გამოიწვიოს არაზუსტი რაოდენობრივი შედეგები
როდესაც რნმ ამოღებულია, ჩვენ მიერ მიღებული რნმ შეიძლება შერეული იყოს გენომიურ დნმ-სთან (gDNA), რომელიც არ არის გაწმენდილი.ამიტომ, საპირისპირო ტრანსკრიფციის შემდეგ cDNA ასევე შერეული იქნებაგდნმ.ქვემო დინების დროსqPCRრეაქცია,cDNAდა gDNA შეიძლება გაძლიერდეს ერთდროულად, რაც გამოიწვევს შედარებით მცირე CT მნიშვნელობას, ამიტომ შედეგები შეიძლება იყოს მიკერძოებული.
მაშ რა უნდა გავაკეთოთ ამ სიტუაციაში?ფორეგენიგვთავაზობს:
(1) შეასრულეთ გენომის გაწმენდა შებრუნებულ რნმ-ზე, რომელიც შეიძლება ამოღებულ იქნეს სვეტის ექსტრაქტით რნმ-ის ექსტრაქციის დროს;
(2) მოპოვებული რნმ დამუშავეთ დნაზითI , მაგრამ შეწყვიტე EDTA-ით;
საპირისპირო ტრანსკრიფციის რეაგენტებიგენომის გამწმენდი მოდულებით;

როგორ ავირჩიოთ პრაიმერები საპირისპირო ტრანსკრიფციისთვის?
საპირისპირო ტრანსკრიფციის პრაიმერები ასევე გავლენას ახდენს საპირისპირო ტრანსკრიფციის რეაქციის შედეგზე.თქვენ შეგიძლიათ აირჩიოთ შემთხვევითი პრაიმერები, Oligo dT ან გენის სპეციფიკური პრაიმერები საპირისპირო ტრანსკრიფციისთვის ექსპერიმენტის კონკრეტული გარემოებების მიხედვით:
(1) სპეციფიური ჩანაწერები: რეკომენდებულია გენის სპეციფიკური პრაიმერები;
(2) გრძელი ფრაგმენტების ტრანსკრიპტები: რეკომენდებულია ოლიგო dT/გენის სპეციფიკური პრაიმერი;
(3) გრძელი სეგმენტის ტრანსკრიპტების შიდა ფრაგმენტები: გენის სპეციფიკური პრაიმერები/ შემთხვევითი პრაიმერები /შემთხვევითი პრაიმერები + Oligo dT.თუ შემდგომი qPCR ექსპერიმენტი ჩატარდება, Oligo dT არ შეიძლება გამოყენებულ იქნას მარტო, რადგან მხოლოდ Oligo dT-ს გამოყენებამ შეიძლება გამოიწვიოს 3' ბოლო მიკერძოება, რაც გამოიწვევს qPCR ექსპერიმენტის არაზუსტ შედეგებს;
(4) miRNA: შეიძლება გამოყენებულ იქნას ღეროვანი მარყუჟის პრაიმერები ან კუდის პრაიმერები.

რამდენჯერ უნდა განზავდეს საპირისპირო ტრანსკრიფციის პროდუქტის cDNA რაოდენობრივი განსაზღვრისთვის?
საპირისპირო ტრანსკრიფციის პროდუქტის cDNA-ს მიღების შემდეგ, რამდენჯერ უნდა განზავდეს cDNA qPCR ექსპერიმენტებისთვის, ძალიან მნიშვნელოვანია.თუ cDNA კონცენტრაცია ძალიან მაღალი ან ძალიან დაბალია, ამპლიფიკაციის ეფექტურობა შეიძლება დაზარალდეს.შეიძლება თუ არა cDNA კონცენტრაციის გაზომვა და როგორ უნდა გაკეთდეს ეს?
(1) საპირისპირო ტრანსკრიფციის პროდუქტის cDNA კონცენტრაცია ვერ გაიზომება, რადგან cDNA პროდუქტის გარდა, საპირისპირო ტრანსკრიფციის პროდუქტი ასევე შეიცავს საპირისპირო ტრანსკრიპციის ნარჩენ ბუფერს, უკუ ტრანსკრიპტაზას, პრაიმერებს და ა.შ.ამ დროს მეგობრები იტყვიან, მერე გავზომავ კონცენტრაციას განწმენდის შემდეგო;აქ Foregene-ს სურს შეახსენოს, რომ cDNA არ არის რეკომენდირებული გასაწმენდად, რადგან შებრუნებით მიღებული cDNA-ის სიგრძე განსხვავებულია და მოკლე cDNA გაწმენდისას დაიკარგება.
(2) რა უნდა გააკეთოს?qPCR ექსპერიმენტამდე, cDNA-ს განზავების გრადიენტი შეიძლება განისაზღვროს წინასწარი ექსპერიმენტის საშუალებით.მაგალითად: გამოიყენეთ cDNA მარაგის ხსნარი, 10-ჯერ განზავება და 100-ჯერ განზავება qPCR ექსპერიმენტების შაბლონებად და აირჩიეთ განზავების ფაქტორი CT მნიშვნელობით 18-28 დიაპაზონში.

როგორ უნდა მოხდეს miRNA-ების საპირისპირო ტრანსკრიბცია?
miRNA არის ერთჯაჭვიანი მცირე მოლეკულის რნმ, რომლის ზომაა დაახლოებით 22 ნტ, რომელიც არ კოდირებს პროტეინს.მისი მოკლე სიგრძის გამო, ჩვეულებრივი qPCR მეთოდი ძნელია მისი პირდაპირ რაოდენობრივად განსაზღვრა, ამიტომ ხშირად საჭიროა miRNA-ს გაფართოება;ჩვეულებრივ გამოყენებული საპირისპირო ტრანსკრიფციის მეთოდები miRNA-სთვის მოიცავს ღეროვანი მარყუჟის მეთოდს და კუდის მეთოდს.
ღეროვანი მარყუჟის მეთოდი არის miRNA-ს გაფართოება ღეროვანი მარყუჟის პრაიმერების დამატებით.ამ გამოვლენის მეთოდს აქვს უფრო მაღალი მგრძნობელობა და სპეციფიკა, მაგრამ გამოვლენის გამტარუნარიანობა დაბალია.ერთ საპირისპირო ტრანსკრიფციას შეუძლია მხოლოდ ერთი miRNA და შიდა მიმართვის აღმოჩენა;კუდის დამატების მეთოდი შედგება ორისაგან და სრულდება ორი ფერმენტის ერთობლივი მოქმედებით, ესენია PolyA პოლიმერაზა და საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა.PolyA პოლიმერაზა პასუხისმგებელია miRNA-სთვის PolyA კუდების დამატებაზე მისი სიგრძის გასაზრდელად, ხოლო საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა ასრულებს საპირისპირო ტრანსკრიფციის რეაქციას.ამ მეთოდს აქვს მაღალი გამოვლენის გამტარუნარიანობა და შეუძლია აღმოაჩინოს მრავალი miRNA და შიდა მითითება ერთ საპირისპირო ტრანსკრიფციაში, მაგრამ მგრძნობელობა და სპეციფიკა დაბალია ღეროვანი მარყუჟის მეთოდში.