ყველა საუბრობს qRT-PCR ექსპერიმენტის პრინციპზე, პრაიმერის დიზაინზე, შედეგის ინტერპრეტაციაზე და ა.შ., მაგრამ ვფიქრობ, უნდა გაგიზიაროთ qRT-PCR-ის ექსპერიმენტული მოქმედება.ეს პატარაა, მაგრამ შედეგია.
სანამ qRT-PCR-ს გავაკეთებთ, ჩვენ უნდა გვქონდეს მკაფიო გაგება ჩვენი რნმ-ისა და ოპერაციის მეთოდების შესახებ.ყოველივე ამის შემდეგ, ჩვენი ძალისხმევა მიზნად ისახავს შედეგის მიღწევას და არა უბრალოდ პრაქტიკას.ამიტომ, სანამ qRT-PCR-ს გავაკეთებთ, უნდა განვსაზღვროთ შემდეგი საკითხები (ზოგიერთი გამოიყენება მხოლოდ SYBR-ზე).
1 დარწმუნებული ხართ, რომ თქვენი რნმ არ არის დეგრადირებული?
NanoDrop 2000-ს შეუძლია აღმოაჩინოს მხოლოდ რნმ-ის კონცენტრაცია და სიწმინდე, მაგრამ ვერ აღმოაჩინოს რნმ-ის მთლიანობა.
რნმ-ის (რნმ ინტესობის რიცხვი) მნიშვნელობას შეუძლია ასახოს რნმ-ის მთლიანობა, რომელიც გამოვლენილია Agilent 2100 Bioanalyzer სისტემის მიერ.
ნახ. RIN მნიშვნელობების სქემატური დიაგრამა რნმ-ის სხვადასხვა ნიმუშებისთვის (ევკარიოტები)
თუმცა, ლაბორატორიებს ზოგადად არ აქვთ Agilent 2100 ბიოანალიზატორი.ამ შემთხვევაში, ჩვენ შეგვიძლია გამოვავლინოთ ფორმალდეჰიდის გელის საშუალებით, მაგრამ მოთხოვნა რნმ-ის საერთო რაოდენობაზე მაღალია, ამიტომ ყველაზე სწრაფი მეთოდია ჩვეულებრივი გელის ელექტროფორეზის გამოყენება.საჭიროა ნუკლეაზასგან თავისუფალ გარემოში ყოფნა, ამიტომ საჭიროა ელექტროფორეზის ავზის, ხსნარის ბოთლის, გელის სამაგრი და სავარცხლის ჩამობანა DEPC წყლით.აგაროზა ასევე არ შეიცავს ნუკლეაზას (სანამ ის ახლად გახსნილია) და დატვირთვის ბუფერი მაქსიმალურად უნდა იყოს ახალი გახსნილი, 1,2% გელით.
გაითვალისწინეთ, რომ გელი მთლიანად უნდა დაიშალა, წინააღმდეგ შემთხვევაში ის გამოიწვევს არაერთგვაროვან ზოლებს, როგორც ეს ნაჩვენებია სურათზე 9 ნიმუშში.თუ ძაბვა ძალიან მაღალია ან ძალიან დიდხანს მუშაობს, წარმოქმნის სითბოს და გამოიწვევს რნმ-ის დეგრადაციას, ამიტომ ძაბვა და დრო გონივრულად უნდა კონტროლდებოდეს.გარდა ამისა, გელის გაშვებას შეუძლია აგრეთვე განსაზღვროს არის თუ არა ნიმუშში დნმ-ის ნარჩენი და დააკვირდეს არის თუ არა დიდი რაოდენობით შეკავებული ზოლები გასანაწილებელ ჭაბურღილში.
ფიგურა.რნმ-ის გელის ელექტროფორეზის გამოვლენა
2 დარწმუნებული ხართ თქვენი cDNA-ს კონცენტრაციაში?
ლაბორატორიაში დიდი ძმების გამოცდილება არის ის, რომ ყოველი ინვერსიით მიღებული 20 ul სისტემის cDNA პირდაპირ განზავებულია 20X, ხოლო პოსტდოქტორანტები 10X.ჩვეულებრივ სიტუაციაზე ვარ დამოკიდებული.იმის გამო, რომ თითოეული ადამიანის მიერ ნახსენები რნმ-ის ხარისხი განსხვავებულია, შებრუნების დონეც განსხვავებულია და შებრუნების ტექნოლოგია შეიძლება არ იყოს სტაბილური.
ასე რომ, ყოველ ჯერზე, როდესაც ვიღებ შებრუნებულ cDNA-ს, ჯერ გავაზავებ მას დაახლოებით 3-ჯერ, შემდეგ კი გამოვიყენებ სახლის მოვლის გენს RT-PCR-ს გასაკეთებლად, ციკლების რაოდენობა ზოგადად 25 ციკლია, კონკრეტული კონცენტრაციის დასადგენად და შემდეგ განზავების საბოლოო ფაქტორის დასადგენად.
3 დარწმუნებული ხართ, რომ თქვენი პრაიმერი მარტივი გამოსაყენებელია?
მას შეუძლია გაიაროს qRT-PCR დნობის მრუდი, მაგრამ ეს მაინც ღირს ფული.ბევრი ფულის გარეშე ლაბორატორიებისთვის, როდესაც ისინი იღებენ უამრავ პრაიმერს, შეუძლიათ გამოიყენონ ჩვეულებრივი RT-PCR, რათა დაინახონ არის თუ არა ეს ერთი ზოლი და დაადგინონ პრაიმერების სპეციფიკა.თუ ლაბორატორიას ფული არ აკლია, ყველა პრაიმერის სპეციფიკა შეიძლება გამოვლინდეს ერთხელ დნობის მრუდის მეშვეობით.
4 დარწმუნებული ხართ, რომ თქვენი ექსპერიმენტული პირობები შესაფერისია?
SYBR დაცული უნდა იყოს ძლიერი განათებისგან, ამიტომ შეეცადეთ გამორთოთ ზედა შუქი SYBR რეაგენტის დამატებისას და მხოლოდ მკრთალი შუქის გამოყენება დაგჭირდებათ მის დასასრულებლად.
შეინახეთ SYBR 4°C ტემპერატურაზე.გამოყენებისას ნაზად გადაატრიალეთ ზევით და ქვევით, რომ კარგად აურიოთ, რათა თავიდან აიცილოთ ქაფი და არ მორევა ენერგიულად.
ზოგიერთ უმცროს დას მოსწონს PCR დაფაზე ნიშნების დახატვა, ნიმუშების შერევის შიშით, რაც არასწორია.იმის გამო, რომ თქვენი მარკერები დიდი ალბათობით იმოქმედებენ ფლუორესცენტური სიგნალების შეგროვებაზე, მე ზოგადად უმცროსებს ვურჩევ გამოიყენონ ექსპერიმენტული ნოუთბუქები მეხსიერების დასახმარებლად, როგორც ეს ნაჩვენებია ქვემოთ.
ფიგურა.qRT-PCR ნიმუშის ჩატვირთვის დიაგრამა
5 დარწმუნებული ხარ რომ სწორად აკეთებ?
აუცილებლად ატარეთ ხელთათმანები, ატარეთ ხელთათმანები, ატარეთ ხელთათმანები და სამჯერ თქვით მნიშვნელოვანი რამ.
იმისათვის, რომ შევამციროთ SYBR-ის შუქზე ზემოქმედება, მე პირადად მსურს ჯერ შაბლონის დამატება, როგორც ეს ნაჩვენებია ქვემოთ მოცემულ ფიგურაში.გამოცდილების მიხედვით, შაბლონის მცირე რაოდენობის დამატებამ შესაძლოა გამოიწვიოს შერჩევის შეცდომები.ამიტომ, მცირე რაოდენობის შაბლონის მიმატებით გამოწვეული შეცდომის შესამცირებლად, ჩვეულებრივ, სინჯს ისევ ვაორმაგებ და ნიმუშის დამატებისას ვაორმაგებ, რათა შევამცირო დამატებული H2O2 რაოდენობა.
ფიგურა.qRT-PCR დატვირთვის სქემატური დიაგრამა
შემდეგ დააკონფიგურირეთ qRT-PCR სისტემა შემდეგნაირად.
ფიგურა.qRT-PCR სისტემის მომზადების დიაგრამა
შენიშვნა: კონფიგურაციის პროცესი უნდა განხორციელდეს ყინულზე.
ნიმუშის დამატების შემდეგ ჩასვით გამჭვირვალე დალუქვის ფილმი.შეეცადეთ არ შეეხოთ გამჭვირვალე დალუქვის ფირის ზედაპირს ხელებით, უბრალოდ იმოქმედეთ ფილმის ორივე მხარეს არსებული სივრციდან.იმის გამო, რომ თითის ანაბეჭდებმა ასევე შეიძლება გავლენა მოახდინოს ფლუორესცენტური სიგნალების შეგროვებაზე.შემდეგ გამოიყენეთ ცენტრიფუგა, რათა სწრაფად მოაწყოთ ცენტრიფუგა 10 წამის განმავლობაში დაბალი სიჩქარით, რათა თავიდან აიცილოთ ნიმუში კედელზე ჩამოკიდების მიზნით.
Მსგავსი პროდუქტები:
გამოქვეყნების დრო: აპრ-28-2023
