RT-qPCR ექსპერიმენტი მოიცავს რნმ-ის ექსტრაქციას და ხარისხის შეფასებას, საპირისპირო ტრანსკრიფციას და qPCR სამ საფეხურს, თითოეულ საფეხურს აქვს უამრავი სიფრთხილის ზომები, ჩვენ დეტალურად გაგაცნობთ ქვემოთ.

Ⅰ.რნმ ხარისხის შეფასება

RT-qPCR ექსპერიმენტში, რნმ-ის ექსტრაქციის დასრულების შემდეგ, საჭიროა რნმ-ის ხარისხის შეფასება და შემდგომი ექსპერიმენტის ჩატარება შესაძლებელია მხოლოდ მას შემდეგ, რაც კვალიფიცირდება.შეფასების მეთოდები მოიცავს სპექტროფოტომეტრს, Agilent გელის ელექტროფორეზის, Agilent 2100 ანალიზს, რომელთა შორის ყველაზე ხშირად გამოიყენება სპექტროფოტომეტრი და აგაროზის გელის ელექტროფორეზის მეთოდის გამოვლენა.უნდა აღინიშნოს, რომ ეს ორი მეთოდი ერთად უნდა იქნას გამოყენებული რნმ-ის კონცენტრაციის, სიწმინდისა და მთლიანობის გამოვლენისა და ანალიზის დასასრულებლად, რათა უზრუნველყოფილ იქნას რნმ-ის ხარისხი.

დაკავშირებული რნმ-ის იზოლაციის ნაკრები: 

უჯრედის მთლიანი რნმ-ის იზოლაციის ნაკრები

მაღალგანწმენდილი და მაღალი ხარისხის მთლიანი რნმ შეიძლება მიღებულ იქნას სხვადასხვა კულტივირებული უჯრედებიდან 11 წუთში.

ცხოველის მთლიანი რნმ-ის იზოლაციის ნაკრები

სწრაფად და ეფექტურად ამოიღეთ მაღალი სისუფთავის და მაღალი ხარისხის მთლიანი რნმ ცხოველების სხვადასხვა ქსოვილებიდან.

სპექტროფოტომეტრი:

სპექტროფოტომეტრი ძირითადად გამოიყენება რნმ-ის კონცენტრაციისა და სიწმინდის დასადგენად, მაგრამ მას არ შეუძლია აღმოაჩინოს რნმ-ის მთლიანობა და გენომის ნარჩენები.მათ შორის, A260/280 და A260/230 მნიშვნელოვანი პარამეტრებია რნმ-ის სისუფთავის გამოვლენისთვის და რნმ-ის სისუფთავის გამოვლენა შესაძლებელია მათი მნიშვნელობების მერყეობის მიხედვით:

1. 1.9< A260/280< 2.1, რაც მიუთითებს, რომ რნმ-ის სისუფთავე კარგია;A260/280<1.9, რაც მიუთითებს, რომ რნმ-ში შესაძლოა იყოს ცილის ნარჩენი;A260/280>2.1, რაც მიუთითებს რნმ-ის შესაძლო ნაწილობრივ დეგრადაციაზე, რაც შემდგომში შეიძლება დადასტურდეს აგაროზის გელის ელექტროფორეზით.

2. 2.0< A260/230< 2.2, რაც მიუთითებს, რომ რნმ-ის სისუფთავე კარგია;A260/230< 2.0, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ რნმ-ში შეიძლება იყოს ორგანული რეაგენტების ნარჩენები, როგორიცაა ფენოლი, ეთანოლი ან შაქარი.

აგაროზის გელის ელექტროფორეზი:

აგაროზის გელის ელექტროფორეზის ანალიზს შეუძლია გააანალიზოს რნმ-ის მთლიანობა, გენომი და ცილის ნარჩენები, მაგრამ არ შეუძლია ზუსტად განსაზღვროს რნმ-ის კონცენტრაცია ან გამოავლინოს ორგანული რეაგენტების ნარჩენები.მაგალითად ავიღოთ ევკარიოტული რნმ-ის შაბლონები:

1. რნმ ექვემდებარებოდა აგაროზის გელის ელექტროფორეზის.თუ გელის რუკაზე იყო 28sRNA, 18sRNA და 5.8sRNA მხოლოდ სამი ცალკეული ზოლი, ეს მიუთითებს, რომ ამოღებული რნმ ხელუხლებელია.თუ არსებობს გადატანის ფენომენი, ეს მიუთითებს რნმ-ის ნაწილობრივ დეგრადაციაზე.

2. თუ წებოს ხვრელსა და 28sRNA ზოლს შორის არის ერთი ნათელი ზოლი, შეიძლება არსებობდეს გენომიური დნმ-ის ნარჩენები.

3. თუ წებოს ხვრელში ზოლები ჩნდება, ეს მიუთითებს იმაზე, რომ შეიძლება იყოს ცილის და სხვა მაკრომოლეკულური ნივთიერებების ნარჩენები.

Ⅱ. საპირისპირო ტრანსკრიფცია

რნმ-ის ექსტრაქციის დასრულების შემდეგ, საჭიროა მისი გადაქცევა cDNA-ში შემდგომი ექსპერიმენტებისთვის, ამიტომ შებრუნების ეტაპი აუცილებელია.საპირისპირო ტრანსკრიპცია დაინერგება საპირისპირო ტრანსკრიპტაზისა და პრაიმერის შერჩევით:

საპირისპირო ტრანსკრიპტაზის შერჩევა:

ტიპიური საპირისპირო ტრანსკრიპტაზები მოიცავს AMV RTase და MMLV RTase.AMV RTase-ს RNase H-ს აქვს ძლიერი აქტივობა, სინთეზის მოკლე სიგრძე, სინთეზის დაბალი რაოდენობა და კარგი თერმული სტაბილურობა (42 ~ 55℃).MMLV RTase-ს RNase H აქტივობა სუსტია, სინთეზის სიგრძე გრძელია, სინთეზის რაოდენობა მაღალია და თერმული სტაბილურობა ცუდია (37 ~ 42℃).

იმის გამო, რომ RNase H ფერმენტს აქვს რნმ-ის შაბლონის დეგრადაციის ფუნქცია, MMLV სუსტი RNase H აქტივობით უპირატესად უნდა შეირჩეს საპირისპირო ტრანსკრიფციის დროს და მოგვიანებით გენეტიკური ინჟინერიის შემდეგ MMLV-ის თერმულმა სტაბილურობამ მიაღწია ხარისხობრივ ნახტომს.ფორეგენის აღებაForeasy Reverse Transcriptase (M-MLV საპირისპირო ტრანსკრიპციისთვის) მაგალითად, ეს არის ახალი საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა, რომელიც გამოხატულია E. coli-ის ინჟინერიულ ბაქტერიებში გენეტიკური რეკომბინაციის ტექნოლოგიის გამოყენებით.ეს არის რეკომბინანტული დნმ პოლიმერაზა, რომელიც სინთეზირებს დნმ-ის დამატებით ჯაჭვს ერთჯაჭვიანი რნმ-დან, დნმ-დან ან რნმ:დნმ ჰიბრიდიდან.მას არ გააჩნია RNase H აქტივობა, ძლიერი სტაბილურობა, ძლიერი რნმ-ის აფინურობა და მაღალი გამოვლენის მგრძნობელობა.

 

Foreasy Reverse Transcriptase (M-MLV საპირისპირო ტრანსკრიპციისთვის)

პრაიმერის შერჩევა:

ზოგადად RT პრაიმერები იყოფა სამ კატეგორიად: oligo dT, შემთხვევითი პრაიმერები და გენის სპეციფიკური პრაიმერები.შეარჩიეთ შესაფერისი პრაიმერები გამოსაყენებლად სხვადასხვა ექსპერიმენტული მოთხოვნების შესაბამისად.

1. თუ შაბლონი ევკარიოტული წარმოშობისაა და გვიანი cDNA გამოიყენება რუტინული PCR ამპლიფიკაციისთვის, რეკომენდებულია Oligo (dT);თუ შემდგომი ექსპერიმენტი გამოიყენება მხოლოდ qPCR-სთვის, ოლიგო (dT) რეკომენდირებულია შემთხვევითი პრაიმერების შერევით, საპირისპირო ტრანსკრიფციის ეფექტურობის გასაუმჯობესებლად.

2. თუ შაბლონი არის პროკარიოტებისგან, შებრუნებული ტრანსკრიფციისთვის უნდა შეირჩეს შემთხვევითი პრაიმერები ან გენის სპეციფიკური პრაიმერები.

Ⅲ.qPCR

ფლუორესცენციის რაოდენობრივი განსაზღვრა ძირითადად შემუშავებულია რაოდენობრივი მეთოდების შერჩევის, პრაიმერის დიზაინის პრინციპების, ROX შერჩევის, რეაქციის სისტემის კონფიგურაციისა და რეაქციის პირობების დაყენებიდან და ა.შ.

რაოდენობრივი მეთოდების შერჩევა:

რაოდენობრივი მეთოდები იყოფა შედარებით რაოდენობრივ მეთოდებად და აბსოლუტურ რაოდენობრივ მეთოდებად.ფარდობითი რაოდენობრივი განსაზღვრა შეიძლება გამოყენებულ იქნას მკურნალობის გარკვეული მეთოდების გავლენის გამოსავლენად გენის ექსპრესიაზე, გამოავლინოს გენის ექსპრესიის განსხვავება სხვადასხვა დროს და შევადაროთ გენის ექსპრესიის განსხვავება სხვადასხვა ქსოვილებში.აბსოლუტურ რაოდენობრივ განსაზღვრას შეუძლია ვირუსში ნუკლეინის მჟავის რაოდენობის დადგენა და ა.შ.ექსპერიმენტების ჩატარებისას უნდა ავირჩიოთ შესაბამისი რაოდენობრივი მეთოდები საკუთარი ექსპერიმენტების მიხედვით.

პრაიმერის დიზაინის პრინციპები:

qPCR-სთვის პრაიმერის დიზაინი პირდაპირ კავშირშია გაძლიერების ეფექტურობასთან და პროდუქტის სპეციფიკასთან.ამიტომ, კარგი პრაიმერების სწორად შემუშავება წარმატებული qPCR-ის პირველი ნაბიჯია.პრაიმერის დიზაინის დროს, ჩვეულებრივი პრაიმერის დიზაინის პრინციპის დაკმაყოფილებისას ყურადღება უნდა მიექცეს შემდეგ პრინციპებს:

1. სამიზნე ფრაგმენტის სიგრძე კონტროლდება 100-დან 300 bp-მდე;

2. ჯვარედინი ეგზონის დიზაინი გენომიური დნმ-ის გავლენის თავიდან ასაცილებლად;

3. დაპროექტებული პრაიმერები საჭიროებს ტესტირებას ამპლიფიკაციის ეფექტურობაზე და მხოლოდ მაშინ, როცა გაძლიერების ეფექტურობა მიაღწევს სტანდარტს (90-110%) მათი გამოყენება რაოდენობრივი ექსპერიმენტებისთვის;

4. პრაიმერის კონცენტრაცია ჩვეულებრივ ოპტიმიზებულია 0.1 მმ-დან 1.0 მმ-მდე.

შერჩევაROX:

რაოდენობრივი რეაქციის პროცესში ROX-ს შეუძლია ოპტიკური ბილიკის სხვაობა, პიპეტინგის შეცდომა ან აორთქლებისა და კონდენსაციის შედეგად გამოწვეული მოცულობის სხვაობა ერთნაირად დაარეგულიროს, რაც აუმჯობესებს შედეგების განმეორებადობას.თუმცა, უნდა აღინიშნოს, რომ ROX-ის შერჩევა ინსტრუმენტს უკავშირდება.თუ qPCR ინსტრუმენტს აქვს ხვრელებს შორის სხვაობის ავტომატურად გამოსწორების ფუნქცია, მას არ სჭირდება ROX-ის დამატება;წინააღმდეგ შემთხვევაში, მას სჭირდება ROX კორექტირების დამატება.რეაგენტების ყიდვისას მცირე პარტნიორები უნდა იყვნენ იმ ინსტრუმენტის მიხედვით, რომელიც გამოიყენება სწორი ROX-ის ასარჩევად, თავიდან აიცილოთ მოგვიანებით შეცდომები.

რეაქციის სისტემის მომზადება:

სასურველია რეაქციის მოცულობა 20 და 50 მლ.სისტემის ჩამოყალიბებისას ყურადღება უნდა მიექცეს შემდეგ საკითხებს:

1. რეაქციის სისტემა უნდა მომზადდეს ვენტილაციის გზით ულტრა სუფთა სამუშაო მაგიდაზე, ახალი ddH₂O გამოიყენება თითოეული ექსპერიმენტისთვის;

2. თითოეულმა ექსპერიმენტმა უნდა მოამზადოს NTC, რათა შეამოწმოს არის თუ არა დაბინძურება სისტემაში, და ყველა წყვილმა პრაიმერმა უნდა გააკეთოს NTC სისტემის მომზადებისას;

3. იმის დასადგენად, არის თუ არა გდნმ-ის ნარჩენი რნმ-ის შაბლონში, NRT შეიძლება მომზადდეს თითოეული ნიმუშისთვის გამოსავლენად;

4. სისტემის მომზადებისას რეკომენდებულია ერთი ნიმუშისთვის მინიმუმ 3 ტექნიკური გამეორების გაკეთება;

5. როდესაც შაბლონი არის cDNA, რეკომენდებულია 5-10-ჯერ განზავება, რათა შემცირდეს საპირისპირო ტრანსკრიფციის სისტემის ინჰიბიციური ეფექტი qPCR ექსპერიმენტზე.უმჯობესია შეისწავლოს შაბლონის რაოდენობა გრადიენტის მიხედვით, ისე, რომ CT მნიშვნელობა დაეცეს 20-30-ს შორის;

6. რეაქციის საჭირო რაოდენობის განსაზღვრა, რეაქციების რაოდენობის მიხედვით 5-10%-ით გაზრდა და მოცულობის კონფიგურაციის რიცხვის გამოთვლა;

7, სისტემა მომზადებულია პრემიქსის პრინციპის გამოყენებით, ცენტრიფუგაციის შემდეგ შერევით და ბუშტების გარეშე;

8, შეძლებისდაგვარად შეარჩიეთ დამხმარე სახარჯო მასალები.

დაკავშირებული RT-qPCR ნაკრები