რნმ არ არის ამოღებული ან რნმ-ის გამოსავლიანობა დაბალია

ხშირად არსებობს სხვადასხვა ფაქტორები, რომლებიც გავლენას ახდენენ აღდგენის ეფექტურობაზე, როგორიცაა: ქსოვილის ნიმუშის რნმ-ის შემცველობა, მოქმედების მეთოდი, ელუციის მოცულობა და ა.შ.

1. ოპერაციის დროს ჩატარდა ყინულის აბაზანა ან კრიოგენული (4 °C) ცენტრიფუგაცია.

რეკომენდაცია: იმუშავეთ ოთახის ტემპერატურაზე (15-25°C) მთელი პროცესის განმავლობაში, არ გააკეთოთ ყინულის აბაზანა და ცენტრიფუგა დაბალ ტემპერატურაზე.

2. ნიმუშის არასწორი შენახვა ან ნიმუშის შენახვის გადაჭარბებული დრო.

რეკომენდაცია: შეინახეთ ნიმუშები -80 °C ტემპერატურაზე ან გაყინეთ თხევად აზოტში და მოერიდეთ გაყინვა-დათბობის განმეორებით გამოყენებას;შეეცადეთ გამოიყენოთ ახალი ქსოვილი ან კულტივირებული უჯრედები რნმ-ის ექსტრაქციისთვის.

3. ნიმუშის არასაკმარისი ლიზისი.

რეკომენდაცია: ქსოვილის ჰომოგენიზაციისას, დარწმუნდით, რომ ქსოვილი საკმარისად ჰომოგენიზებულია და ქსოვილის უჯრედები საკმარისად იყოფა რნმ-ის გამოყოფის ასახსნელად.

4. ელუენტი არასწორად არის დამატებული.

რეკომენდაცია: დაადასტურეთ, რომ RNase-ის გარეშე ddH₂O ემატება წვეთობრივად გამწმენდი სვეტის მემბრანის შუაში.

5. აბსოლუტური ეთანოლის სწორი მოცულობა არ დაემატა ბუფერ RL2-ს ან ბუფერს RW2-ს.

რეკომენდაცია: მიჰყევით ინსტრუქციას, დაამატეთ აბსოლუტური ეთანოლის სწორი მოცულობა Buffer RL2 და Buffer RW2 და კარგად აურიეთ ნაკრების გამოყენებამდე.

6. ქსოვილის ნიმუშის დოზა არ არის შესაბამისი.

რეკომენდაცია: გამოიყენეთ 10-20 მგ ქსოვილი ან (1-5) × 10⁶უჯრედები 500 μl ბუფერულ RL1-ზე, რადგან ქსოვილის გადაჭარბებულმა გამოყენებამ შეიძლება გამოიწვიოს რნმ-ის ექსტრაქციის შემცირება.

7. გამორეცხვის არასწორი მოცულობა ან არასრული ელუცია.

რეკომენდაცია: გამწმენდი სვეტის გამორეცხვის მოცულობა არის 50-200 μl;თუ გამორეცხვის ეფექტი არ არის დამაკმაყოფილებელი, რეკომენდებულია ოთახის ტემპერატურის განლაგების დროის გახანგრძლივება წინასწარ გახურებული RNase-ის გარეშე ddH-ის დამატების შემდეგ.₂O, მაგ. 5-10 წთ.

8. გამწმენდ სვეტს აქვს ეთანოლის ნარჩენი ბუფერული RW2 გარეცხვის შემდეგ.

რეკომენდაცია: თუ ბუფერული RW2 რეცხვის შემდეგ არის ეთანოლის ნარჩენები, ცარიელ მილში ცენტრიფუგირება 1 წთ, ცარიელი მილის ცენტრიფუგაციის დრო შეიძლება გაიზარდოს 2 წთ-მდე, ან გამწმენდი სვეტი შეიძლება განთავსდეს ოთახის ტემპერატურაზე 5 წუთის განმავლობაში, რათა ადეკვატურად მოიხსნას ნარჩენი ეთანოლი.

გასუფთავებული რნმ იშლება

გასუფთავებული რნმ-ის ხარისხი დაკავშირებულია ისეთ ფაქტორებთან, როგორიცაა ნიმუშის შენარჩუნება, RNase დაბინძურება და მანიპულირება და ა.შ.

1. ქსოვილის ნიმუშები დროულად არ ინახება.

რეკომენდაცია: თუ ქსოვილის ნიმუშები ან უჯრედები არ იქნა გამოყენებული დროულად შეგროვების შემდეგ, დაუყოვნებლივ შეინახეთ კრიოკონსერვაცია -80 °C-ზე ან თხევადი აზოტით.რნმ-ის ამოსაღებად, შეძლებისდაგვარად გამოიყენეთ ახლად აღებული ქსოვილის ან უჯრედის ნიმუში.

2. ქსოვილის ნიმუშების განმეორებითი გაყინვა-დათბობა.

რეკომენდაცია: ქსოვილის ნიმუშების შენახვისას უმჯობესია დაჭრათ ისინი მცირე ნაჭრებად შესანარჩუნებლად და ამოიღოთ ერთი ნაწილი მათი გამოყენებისას, რათა თავიდან აიცილოთ ნიმუშის განმეორებითი გაყინვა-დათბობა და რნმ-ის დეგრადაცია.

3. RNase შეყვანილია ან არ ატარებს ერთჯერადი ხელთათმანებს, ნიღბებს და ა.შ.

რეკომენდაცია: რნმ-ის ექსტრაქციის ექსპერიმენტები საუკეთესოდ ჩატარდება რნმ-ის მანიპულაციის ცალკეულ ოთახებში და ცხრილი გასუფთავდება ექსპერიმენტამდე.

ატარეთ ერთჯერადი ხელთათმანები და ნიღბები ექსპერიმენტის დროს, რათა მინიმუმამდე დაიყვანოთ რნმ-ის დეგრადაცია, რომელიც გამოწვეულია RNase-ს შეყვანით.

4. გამოყენებისას რეაგენტები დაბინძურებულია RNase-ით.

რეკომენდაცია: ჩაანაცვლეთ ახალი ცხოველის ტოტალური რნმ-ის იზოლაციის ნაკრებით შესაბამისი ექსპერიმენტებისთვის.

5. რნმ-ით მანიპულირებაში გამოყენებული ცენტრიფუგის მილები, წვერები და ა.შ. დაბინძურებულია RNase-ით.

რეკომენდაცია: დაადასტურეთ, რომ ცენტრიფუგის მილები, წვერები, პიპეტები და ა.შ., რომლებიც გამოიყენება რნმ-ის ექსტრაქციაში, არ შეიცავს RNase-ს.

გაწმენდილი მიღებული რნმ გავლენას ახდენს ქვედა დინების ექსპერიმენტებზე

გამწმენდი სვეტით გაწმენდილი რნმ, თუ მარილის იონები, ცილის შემცველობა ძალიან დიდია, გავლენას მოახდენს ქვედა დინების ექსპერიმენტზე, როგორიცაა: საპირისპირო ტრანსკრიფცია, ჩრდილო ბლოტი და სხვ.

1. გამოყოფილ რნმ-ს აქვს მარილის იონის ნარჩენები.

რეკომენდაცია: დაადასტურეთ, რომ ეთანოლის სწორი მოცულობა დაემატა Buffer RW2-ს და შეასრულეთ 2 გამწმენდი სვეტის რეცხვა სამუშაოსთვის მითითებული ცენტრიდანული სიჩქარით;თუ არსებობს მარილის იონის ნარჩენები, დატოვეთ გამწმენდი სვეტი ბუფერულ RW2-ში 5 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე და განახორციელეთ ცენტრიფუგაცია მარილით დაბინძურების მაქსიმალურად მოსაშორებლად.

2. ეთანოლის ნარჩენი გამოყოფილ რნმ-ში.

რეკომენდაცია: დაადასტურეთ, რომ ბუფერული RW2 რეცხვის შემდეგ, შეასრულეთ ცარიელი მილის ცენტრიფუგაციის ოპერაცია მუშაობისთვის მითითებულ ცენტრიფუგაციის სიჩქარით, გაზარდეთ ცარიელი მილის ცენტრიფუგაციის დრო 2 წუთამდე, თუ ჯერ კიდევ არის ეთანოლის ნარჩენები, ან დატოვეთ იგი ოთახის ტემპერატურაზე 5 მ.