გამოვლენის სპეციფიკა
უმეტეს შემთხვევაში, პრაიმერის დიზაინის მიზანია PCR-ის სპეციფიკის მაქსიმალურად გაზრდა.ეს განისაზღვრება მრავალი ცვლადის მეტ-ნაკლებად პროგნოზირებადი გავლენით.ერთ-ერთი მნიშვნელოვანი ცვლადი არის თანმიმდევრობა პრაიმერის მე-3' ბოლოს.
მნიშვნელოვანია, რომ სპეციფიკურობისთვის შექმნილი PCR ანალიზები უფრო მეტად ინარჩუნებენ მაღალ ეფექტურობას ფართო დინამიურ დიაპაზონში, რადგან ანალიზი არ აწარმოებს არასპეციფიკურ ამპლიფიკაციის პროდუქტებს, რითაც კონკურენციას უწევს PCR რეაგენტებს ან აფერხებს ძირითად გამაძლიერებელ რეაქციას.
რა თქმა უნდა, ზოგიერთ შემთხვევაში, სპეციფიკა არ არის ყველაზე მნიშვნელოვანი, მაგალითად, როდესაც მიზანია მჭიდროდ დაკავშირებული, მაგრამ განსხვავებული პათოგენების რაოდენობრივი შეფასება, საჭიროა სპეციალური დიზაინი, ოპტიმიზაცია და გადამოწმების სტანდარტები.
დნობის მრუდი არის სტანდარტული მეთოდი ამპლიკონების სპეციფიკის შესაფასებლად, თუნდაც ერთი სამიზნის გაძლიერების თვალსაზრისით.თუმცა, ხაზგასმით უნდა აღინიშნოს, რომ დნობის მრუდები შეიძლება იყოს შეცდომაში შემყვანი, რადგან, მაგალითად, მათზე შეიძლება გავლენა იქონიოს არაოპტიმალური პრაიმერებისა და შაბლონის დაბალი კონცენტრაციების კომბინირებული ეფექტებით.
P5 |დნობის მრუდი გვიჩვენებს Tm ძვრებს, რომლებიც მიიღება ორი სამიზნე დნმ-ის სხვადასხვა რაოდენობის ორი გამოვლენისგან.
A. უფრო მაღალ კონცენტრაციებში (ad)), არ არის აშკარა პრაიმერის დიმერი qPCR გაზომვის დასრულების შემდეგ.როდესაც შაბლონის კონცენტრაცია მცირდება 50 ეგზემპლარამდე (e), იწყება არასპეციფიკური პროდუქტის გამოჩენა და ხდება ერთადერთი პროდუქტი ყველაზე დაბალი კონცენტრაციით (f).
B. ტესტმა დააფიქსირა იგივე Tms ყველა სამიზნე კონცენტრაციაზე და არ იყო აშკარა პრაიმერის დიმერი თუნდაც ყველაზე დაბალ კონცენტრაციაზე (5 ასლი).ამ ორი გამოვლენის მეთოდის გამოყენებისას, არ იყო აღმოჩენილი გამაძლიერებელი პროდუქტები NTC-ებში.
P5 გვიჩვენებს დაშლის მრუდებს, რომლებიც მიიღება ნიმუშებით, რომლებშიც შაბლონი წარმოდგენილია სხვადასხვა კონცენტრაციით.P 5a გვიჩვენებს, რომ ორ ყველაზე დაბალ კონცენტრაციაზე წარმოებული არასპეციფიკური გამაძლიერებელი პროდუქტების Tms უფრო დაბალია, ვიდრე სპეციფიკური ამპლიკონების.
ცხადია, ამ გამოვლენის მეთოდის საიმედოდ გამოყენება შეუძლებელია დაბალ კონცენტრაციებში არსებული სამიზნეების გამოსავლენად.
საინტერესოა, რომ NTC-ები, ანუ ნიმუშები, რომლებსაც საერთოდ არ აქვთ დნმ, არ აღრიცხავენ (არასპეციფიკურ) ამპლიფიკაციის პროდუქტებს, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ ფონური გენომის დნმ-ს შეუძლია მონაწილეობა მიიღოს არასპეციფიკურ გაძლიერებაში/პოლიმერიზაციაში.
ზოგჯერ ასეთი ფონური პრაიმერები და არასპეციფიკური გაძლიერება ვერ გამოსწორდება, მაგრამ ხშირად შესაძლებელია გამოვლენის მეთოდის შემუშავება, რომელსაც არ ექნება არასპეციფიკური გაძლიერება შაბლონის რომელიმე კონცენტრაციაში და NTC (P 5b).
აქ, თუნდაც ჩაწეროთ სამიზნე კონცენტრაციის გაძლიერება Cq 35-ით, წარმოქმნის სპეციფიკურ დაშლის მრუდს.ანალოგიურად, NTC-ებმა არ აჩვენეს არასპეციფიკური გაძლიერების ნიშნები.ზოგჯერ, გამოვლენის ქცევა შეიძლება იყოს დამოკიდებული დედალი ლიქიორზე და მხოლოდ არასპეციფიკური გაძლიერება გამოვლინდება გარკვეულ ბუფერულ კომპოზიციებში, რაც შეიძლება დაკავშირებული იყოს სხვადასხვა Mg2+ კონცენტრაციასთან.
გამოვლენის სტაბილურობა
Ta-ს ოპტიმიზაცია სასარგებლო ნაბიჯია qPCR გამოვლენის ემპირიული შემოწმებისა და ოპტიმიზაციის პროცესში.ის იძლევა პირდაპირ მითითებას პრაიმერის კომპლექტის სიმტკიცეზე ტემპერატურის (ან ტემპერატურის დიაპაზონის) ჩვენებით, რომელიც წარმოქმნის ყველაზე დაბალ Cq-ს NTC-ის გაძლიერების გარეშე.
მგრძნობელობის ორ-ოთხჯერ განსხვავება შეიძლება არ იყოს მნიშვნელოვანი mRNA მაღალი ექსპრესიის მქონე ადამიანებისთვის, მაგრამ დიაგნოსტიკური ტესტებისთვის ეს შეიძლება ნიშნავდეს განსხვავებას დადებით და ცრუ უარყოფით შედეგებს შორის.
qPCR პრაიმერების Ta თვისებები შეიძლება მნიშვნელოვნად განსხვავდებოდეს.ზოგიერთი ტესტი არ არის ძალიან მტკიცე და თუ ისინი არ ჩატარდება პრაიმერების ოპტიმალური Ta მნიშვნელობის ქვეშ, ისინი სწრაფად იშლება.
ეს მნიშვნელოვანია, რადგან ამ ტიპის აღმოჩენა ხშირად პრობლემატურია რეალურ სამყაროში და ნიმუშის სისუფთავე, დნმ-ის კონცენტრაცია ან სხვა დნმ-ის არსებობა შეიძლება არ იყოს ოპტიმალური.
გარდა ამისა, სამიზნე ასლის ნომერი შეიძლება განსხვავდებოდეს ფართო დიაპაზონში და რეაგენტები, პლასტმასის ჭურჭელი ან ინსტრუმენტები შეიძლება განსხვავდებოდეს ტესტის დაყენებისას გამოყენებულისგან.
P6|ტემპერატურული გრადიენტი აჩვენებს PCR გამოვლენის განსხვავებულ გამძლეობას.
ა. გამოიყენეთ Bioline-ის Sensifast SYBR მასტერმიქსი (კატალოგის ნომერი BIO-98050) PCR-ის შესასრულებლად cDNA-ზე, რომელიც მომზადებულია ადამიანის ტვინის რნმ-ისგან.
B. გამოიყენეთ Bio-Rad-ის CFX qPCR ინსტრუმენტი, რათა ჩაწეროთ აპალენის გამაძლიერებელი რუკა და დაშლის მრუდი (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).
C. ACSBG1-ის გაძლიერების გრაფიკი და დნობის მრუდი (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).
D. GFAP-ის გაძლიერების გრაფიკი და დაშლის მრუდი (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCTCTCGTGGATCTTC).
E. Cqs ჩაწერილი სხვადასხვა ანეილირების ტემპერატურაზე, რაც აჩვენებს განსხვავებას Cq-ში დაფიქსირებული 7C ტემპერატურის გრადიენტის ქვეშ.
P6 გვიჩვენებს არასასურველი ტესტის ტიპურ შედეგს, სადაც qPCR ჩატარდა გრადიენტის Tas-ის გამოყენებით 59C-დან 67C-მდე (P 6a), პრაიმერების გამოყენებით სამი ადამიანის ტვინის სპეციფიკური გენისთვის.
ამპლიფიკაციის გრაფიკიდან ჩანს, რომ Opalin პრაიმერები შორს არიან იდეალურისგან, რადგან მათი ოპტიმალური Ta დიაპაზონი ძალიან ვიწროა (სურათი 6b), ანუ Cqs ფართოდ არის გაფანტული, რის შედეგადაც Cqs მნიშვნელოვნად შედარებულია მათ ოპტიმალურ Cqs დაბალთან.
გამოვლენის ეს მეთოდი არასტაბილურია და შეიძლება გამოიწვიოს არაოპტიმალური გაძლიერება.ამიტომ, ამ წყვილი პრაიმერი უნდა გადაიხედოს.გარდა ამისა, დნობის მრუდის ანალიზი (ჩასმა) გვიჩვენებს, რომ ამ გამოვლენის მეთოდის სპეციფიკაც შეიძლება იყოს პრობლემატური, რადგან თითოეული Ta-ს დნობის მრუდი განსხვავებულია.
P 6c-ში ნაჩვენები ACSBG1 გამოვლენის მეთოდი უფრო მტკიცეა ვიდრე ზემოთ მოყვანილი ოპალინის გამოვლენის მეთოდი, მაგრამ ის მაინც შორს არის იდეალურისგან და სავარაუდოა, რომ მისი გაუმჯობესება შესაძლებელია.
თუმცა, ჩვენ ხაზს ვუსვამთ იმას, რომ არ არსებობს აუცილებელი კავშირი გამძლეობასა და სპეციფიკას შორის, რადგან ამ გამოვლენის მეთოდით წარმოქმნილი დაშლის მრუდი აჩვენებს ერთსა და იმავე პიკს ყველა Tas-ში (ჩასმა).
მეორეს მხრივ, გამძლეობის ტესტი ბევრად უფრო ტოლერანტულია, წარმოქმნის მსგავს Cq-ებს Tas-ების ფართო დიაპაზონში, როგორც P 6d-ში ნაჩვენები GFAP ტესტში.
იგივე 8 გრადუს ცელსიუსის დიაპაზონში მიღებულ Cq-ებში სხვაობა 1-ზე ნაკლებია და დაშლის მრუდი (ჩასმა) ადასტურებს გამოვლენის მახასიათებლებს ამ ტემპერატურის დიაპაზონში.აღსანიშნავია, რომ გამოთვლილი Tas და რეალური Ta დიაპაზონი შეიძლება ძალიან განსხვავებული იყოს.
არსებობს მრავალი გზამკვლევი, რომელიც შექმნილია მკვლევარებისთვის ეფექტური პრაიმერების შემუშავებაში, რომელთა უმეტესობა ეფუძნება დიდი ხნის განმავლობაში დადგენილ წესებს და დიდი ყურადღება დაეთმო პრაიმერების მე-3 დასასრულს.ხშირად რეკომენდირებულია ჩართოთ G ან C 3' ბოლოში და ორი G ან C ბაზა (GC clamp), მაგრამ არაუმეტეს ორი ბოლო 5 ბაზიდან.
პრაქტიკაში, ამ წესებს შეუძლიათ იხელმძღვანელონ მკვლევარებისთვის, მაგრამ ისინი აუცილებლად არ არის სწორი ყველა ვითარებაში.
P7 |პრაიმერის მე-3 ბოლო არ მოქმედებს სპეციფიკურობაზე ან ეფექტურობაზე.
ა. პრაიმერების პოზიცია ადამიანის HIF-1α (NM_181054.2) გენისთვის.
B. გამოიყენეთ Agilent Brilliant III SYBR მწვანე დედა ლიქიორი (კატ. No. 600882) ექვსი სატესტო ელემენტის გასაძლიერებლად.
C. გაძლიერების გრაფიკი და დნობის მრუდი ჩაწერილი Bio-Rad's CFX qPCR ინსტრუმენტით და 3'ბოლო პრაიმერებით.NTC ნაჩვენებია წითლად.
D. Cqs ჩანაწერი თითოეული ტესტის ელემენტის შესახებ
მაგალითად, P7-ის შედეგი ეწინააღმდეგება 3'ბოლო წესს.ყველა დიზაინი იძლევა ძირითადად ერთსა და იმავე შედეგებს, მხოლოდ ორი პრაიმერის კომბინაციით იწვევს არასპეციფიკურ გაძლიერებას NTC-ში.
თუმცა, ჩვენ ვერ დავუჭერთ მხარს GC კლიპის ეფექტს, რადგან ამ შემთხვევაში A ან T-ის გამოყენება მაქსიმუმ 30 ბაზის სახით არ ამცირებს სპეციფიკურობას.
ტესტი C, სადაც F პრაიმერი მთავრდება GGCC-ში, ჩაწერა Cq-ები NTC-ებში, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ შეიძლება მოისურვოთ ამ თანმიმდევრობების თავიდან აცილება 30 ბოლოში.ჩვენ ხაზს ვუსვამთ, რომ ერთადერთი გზა პრაიმერის წყვილის საუკეთესო 3' ბოლო მიმდევრობის დასადგენად არის ზოგიერთი კანდიდატი პრაიმერის ექსპერიმენტული შეფასება.
გაძლიერების ეფექტურობა
მნიშვნელოვანია, მიუხედავად იმისა, რომ არასპეციფიკური PCR გამოვლენა ვერასოდეს გახდება სპეციფიკური, გაძლიერების ეფექტურობა შეიძლება დარეგულირდეს და გაზარდოს სხვადასხვა გზით ფერმენტის, დედა ლიქიორის, დანამატების და ციკლური პირობების შეცვლით.
PCR გამოვლენის ეფექტურობის შესაფასებლად, უმჯობესია გამოიყენოთ სერიული განზავების 10 ან 5-ჯერ მეტი სამიზნე ნუკლეინის მჟავა, ანუ "სტანდარტული მრუდის მეთოდი".
თუ PCR ამპლიკონები ან სინთეზური დნმ-ის სამიზნეები გამოიყენება სტანდარტული მრუდის შესაქმნელად, ამ სამიზნეების სერიული განზავება უნდა იყოს შერეული ფონის დნმ-ის მუდმივი რაოდენობით (როგორიცაა გენომიური დნმ).
P8 |განზავების მრუდი PCR-ის ეფექტურობის შესაფასებლად.
ა. გამოიყენეთ პრაიმერები HIF-1-ისთვის: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA და R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC და Agilent's Brilliant III SYBR Green მასტერმიქსი (კატალოგის ნომერი 600882) PCR და დნობის მრუდის პირობებისთვის.
B. 100 ნგ რნმ გადაწერილი იქნა საპირისპირო, განზავებული 2-ჯერ და სერიულად განზავებული cDNA ნიმუშები განზავებული იყო 5-ჯერ 1 ნგ ადამიანის გენომის დნმ-მდე.დნობის მრუდი ნაჩვენებია ჩასმაში.
C. RT რეაქცია, განზავება და სერიული განზავება განმეორდა მეორე cDNA ნიმუშისთვის და შედეგები მსგავსი იყო.
P 8 გვიჩვენებს ორ სტანდარტულ მრუდს, იგივე გამოვლენის მეთოდის გამოყენებით ორ სხვადასხვა cDNA ნიმუშზე, შედეგი არის იგივე ეფექტურობა, დაახლოებით 100%, და R2 მნიშვნელობა ასევე მსგავსია, ანუ შეესაბამება ექსპერიმენტულ მონაცემებსა და რეგრესიის ხაზს შორის ან მონაცემთა წრფივობის ხარისხი.
ორი სტანდარტული მრუდი შესადარებელია, მაგრამ არა ზუსტად იგივე.თუ მიზანია მიზნის ზუსტად რაოდენობრივი დადგენა, უნდა აღინიშნოს, რომ დაუშვებელია ასლის ნომრის გამოთვლა გაურკვევლობის ახსნის გარეშე.
P9 |გაზომვის გაურკვევლობა, რომელიც დაკავშირებულია რაოდენობებთან სტანდარტული მრუდის გამოყენებით.
ა. გამოიყენეთ პრაიმერები GAPDH-სთვის (NM_002046) PCR და დნობის მრუდის პირობების შესასრულებლად.F: ACAGTTGCCATGTAGACC და R: TAACTGGTTGAGCACAGG და Bioline-ის Sensifast SYBR მასტერმიქსი (კატალოგის ნომერი BIO-98050).
B. გამაძლიერებელი სქემა, დნობის მრუდი და სტანდარტული მრუდი ჩაწერილი Bio-Rad-ის CFX qPCR ინსტრუმენტით.
C. სტანდარტული მრუდის გრაფიკი და 95% ნდობის ინტერვალი (CI).
დ. განზავების მრუდიდან მიღებული სამი Cq მნიშვნელობის ასლის რაოდენობა და 95% ნდობის ინტერვალი.
P 9 გვიჩვენებს, რომ ოპტიმიზებული ტესტისთვის, ერთი სტანდარტული მრუდის თანდაყოლილი ცვალებადობა არის დაახლოებით 2-ჯერ (95% ნდობის ინტერვალი, მინიმალური მაქსიმუმამდე), რაც შეიძლება იყოს ყველაზე მცირე ცვალებადობა, რაც შეიძლება მოსალოდნელი იყოს.
დაკავშირებული პროდუქტი:
ცხოველთა ქსოვილის პირდაპირი PCR ნაკრები
გამოქვეყნების დრო: სექ-30-2021
