Cell Direct RT qPCR ნაკრები — SYBR GREEN I Direct Cell Lysis Cell Ready ერთსაფეხურიანი qRT-PCR კომპლექტები
აღწერილობები
ეს ნაკრები იყენებს უნიკალურ ლიზის ბუფერულ სისტემას, რომელსაც შეუძლია სწრაფად გაათავისუფლოს რნმ კულტივირებული უჯრედის ნიმუშებიდან RT-qPCR რეაქციებისთვის, რითაც გამორიცხავს რნმ-ის გაწმენდის დროს შრომატევად პროცესს.რნმ-ის შაბლონის მიღება შესაძლებელია მხოლოდ 7 წუთში.5×პირდაპირი RT Mix და 2×პირდაპირი qPCR Mix-SYBR რეაგენტები, რომლებიც უზრუნველყოფილია ნაკრებით, შეუძლიათ სწრაფად და ეფექტურად მიიღონ რეალურ დროში რაოდენობრივი PCR შედეგები.
5×პირდაპირი RT Mix და 2×პირდაპირი qPCR Mix-SYBR-ს აქვს ძლიერი ინჰიბიტორების ტოლერანტობა და ნიმუშების ლიზატი შეიძლება გამოყენებულ იქნას როგორც შაბლონი RT-qPCR-სთვის პირდაპირ.ეს ნაკრები შეიცავს უნიკალურ რნმ-ს მაღალი აფინურობის Foregene საპირისპირო ტრანსკრიპტაზას და Hot D-Taq დნმ პოლიმერაზას, dNTPs, MgCl2, რეაქციის ბუფერი, PCR ოპტიმიზატორი და სტაბილიზატორი.
სპეციფიკაციები
200×20μლ Rxns, 1000×20μლ Rxns
ნაკრების კომპონენტები
| ნაწილი I | ბუფერი CL |
| Foregene Protease Plus II | |
| ბუფერი ST | |
| ნაწილი II | დნმ-ის საშლელი |
| 5× პირდაპირი RT მიქსი | |
| 2× Direct qPCR Mix-SYBR | |
| 50× ROX Reference საღებავი | |
| RNase-ის გარეშე ddH2O | |
| ინსტრუქციები | |
მახასიათებლები და უპირატესობები
■მარტივი და ეფექტური: Cell Direct RT ტექნოლოგიით, რნმ-ის ნიმუშების მიღება შესაძლებელია მხოლოდ 7 წუთში.
■ ნიმუშის მოთხოვნა მცირეა, შესაძლებელია 10 უჯრედის ტესტირება.
■ მაღალი გამტარუნარიანობა: მას შეუძლია სწრაფად აღმოაჩინოს რნმ უჯრედებში, რომლებიც კულტივირებულია 384, 96, 24, 12, 6 ჭაბურღილის ფირფიტებში.
■ დნმ-ის საშლელს შეუძლია სწრაფად ამოიღოს გამოთავისუფლებული გენომები, მნიშვნელოვნად შეამციროს გავლენა შემდგომ ექსპერიმენტულ შედეგებზე.
■ ოპტიმიზებული RT და qPCR სისტემა ხდის ორეტაპიან RT-PCR საპირისპირო ტრანსკრიფციას უფრო ეფექტურს და PCR-ს უფრო სპეციფიკურს და უფრო გამძლეს RT-qPCR რეაქციის ინჰიბიტორების მიმართ.
ნაკრების აპლიკაცია
გამოყენების სფერო: კულტივირებული უჯრედები.
- ნიმუშის ლიზისით გამოთავისუფლებული რნმ: გამოიყენება მხოლოდ ამ ნაკრების RT-qPCR შაბლონზე.
- ნაკრების გამოყენება შესაძლებელია შემდეგი მიზნებისთვის: გენის ექსპრესიის ანალიზი, siRNA-ს შუამავლობით გენის გამაჩუმებელი ეფექტის შემოწმება, წამლების სკრინინგი და ა.შ.
დიაგრამა
შენახვა და შენახვის ვადა
ამ ნაკრების I ნაწილი უნდა ინახებოდეს 4℃ ტემპერატურაზე;II ნაწილი უნდა ინახებოდეს -20℃ ტემპერატურაზე.
Foregene Protease Plus II უნდა ინახებოდეს 4-ზე℃, არ გაყინოთ -20℃.
რეაგენტი 2×Direct qPCR Mix-SYBR უნდა ინახებოდეს -20-ზე℃სიბნელეში;თუ ხშირად გამოიყენება, ის ასევე შეიძლება შენახული იყოს 4-ზე℃ მოკლევადიანი შენახვისთვის (გამოიყენება 10 დღის განმავლობაში).
რეალურ დროში PCR პრაიმერის დიზაინის პრინციპები
Forward Primer და Reverse Primer
Real Time PCR-სთვის პრაიმერის დიზაინი ძალიან მნიშვნელოვანია.პრაიმერები დაკავშირებულია PCR გაძლიერების სპეციფიკასთან და ეფექტურობასთან და შეიძლება შეიქმნას შემდეგი პრინციპების მიხედვით:
პრაიმერის სიგრძე: 18-30bp.
GC შემცველობა: 40-60%.
Tm მნიშვნელობა: პრაიმერის დიზაინის პროგრამულ უზრუნველყოფას, როგორიცაა Primer 5, შეუძლია პრაიმერის Tm მნიშვნელობა მისცეს.ზედა და ქვედა დინების პრაიმერების Tm მნიშვნელობები უნდა იყოს რაც შეიძლება ახლოს.ასევე შეიძლება გამოყენებულ იქნას Tm გამოთვლის ფორმულა: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).PCR-ის ჩატარებისას, პრაიმერის Tm მნიშვნელობის 5 °C-ზე დაბალი ტემპერატურა, როგორც წესი, შეირჩევა ანეილირების ტემპერატურად (შედუღების ტემპერატურის შესაბამისმა ზრდამ შეიძლება გაზარდოს PCR რეაქციის სპეციფიკა).
პრაიმერი და PCR პროდუქტები:
დიზაინის პრაიმერის PCR გამაძლიერებელი პროდუქტის სიგრძე სასურველია იყოს 100-150bp.
შეძლებისდაგვარად თავიდან უნდა იქნას აცილებული დიზაინის პრაიმერები შაბლონის მეორად სტრუქტურულ ზონაში.
მოერიდეთ 2 ან მეტი დამატებითი ფუძის წარმოქმნას ზედა და ქვედა დინების პრაიმერების 3' ბოლოებს შორის.
პრაიმერის 3' ტერმინალის ბაზა არ შეიძლება იყოს 3 დამატებითი თანმიმდევრული G ან C.
თავად პრაიმერებს არ შეიძლება ჰქონდეთ დამატებითი სტრუქტურები, წინააღმდეგ შემთხვევაში წარმოიქმნება თმის სამაგრი სტრუქტურა, რაც გავლენას მოახდენს PCR გაძლიერებაზე.
ATCG უნდა განაწილდეს რაც შეიძლება თანაბრად პრაიმერის თანმიმდევრობით და 3' ტერმინალური ბაზა თავიდან უნდა იქნას აცილებული, როგორც T.
დანართი 1: Cell Direct RT-qPCR Kit კომპონენტის დანამატის პაკეტი
1.უჯრედის ლიზისის ხსნარი
|
| |||
| ნაკრების კომპონენტები (24 ჭაბურღილის ლიზის სისტემა / ჭა) | DRT-01011-A1 | DRT-01011-A2 | |
| 100 ტ | 500 ტ | ||
| ნაწილიმე | ბუფერი CL | 20 მლ | 100 მლ |
| Foregene Protease Plus II | 400 მლ | 1 მლ × 2 | |
| ბუფერი ST | 1 მლ × 2 | 10 მლ | |
| ნაწილიII | დნმ-ის საშლელი | 400 მლ | 1 მლ × 2 |
2.RT Mix
|
| |
| ნაკრების კომპონენტები (20 მლ რეაქციის სისტემა) | DRT-01011-B1 |
| 200 ტ | |
| 5× პირდაპირი RT მიქსი | 800 მლ |
| RNase-ის გარეშე ddH2O | 1.7 მლ × 2 |
|
| ||
| ნაკრების კომპონენტები (20 მლ რეაქციის სისტემა) | DRT-01011-C1 | DRT-01011-C2 |
| 200 ტ | 1000 ტ | |
| 2× Direct qPCR Mix-SYBR | 1 მლ × 2 | 1.7 მლ × 6 |
| 50× ROX Reference საღებავი | 40 მლ | 200 მლ |
| RNase-ის გარეშე ddH2O | 1,7 მლ | 10 მლ |
ინსტრუქციის სახელმძღვანელოები:
