RT-qPCR შემუშავებულია ჩვეულებრივი PCR ტექნოლოგიით.ის ამატებს ფლუორესცენტურ ქიმიკატებს (ფლუორესცენტური საღებავები ან ფლუორესცენტური ზონდები) ტრადიციულ PCR რეაქციის სისტემას და აღმოაჩენს PCR ანეილირების და გაფართოების პროცესს რეალურ დროში მათი სხვადასხვა ლუმინესცენტური მექანიზმების მიხედვით.ფლუორესცენტური სიგნალის ცვლილებები გარემოში გამოიყენება PCR-ის თითოეულ ციკლში პროდუქტის ცვლილების ოდენობის გამოსათვლელად.ამჟამად, ყველაზე გავრცელებული მეთოდებია ფლუორესცენტური საღებავის მეთოდი და ზონდის მეთოდი.

ფლუორესცენტური საღებავის მეთოდი:
ზოგიერთი ფლუორესცენტური საღებავი, როგორიცაა SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO და ა.შ., თავისთავად არ ასხივებს სინათლეს, მაგრამ ასხივებს ფლუორესცენციას dsDNA-ს უმნიშვნელო ღართან შეკავშირების შემდეგ.ამიტომ, PCR რეაქციის დასაწყისში, მანქანა ვერ აღმოაჩენს ფლუორესცენტურ სიგნალს.როდესაც რეაქცია მიდის ანეილირება-გაფართოების (ორსაფეხურიანი მეთოდი) ან გაფართოების სტადიაზე (სამსაფეხურიანი მეთოდი), ამ დროს იხსნება ორმაგი ძაფები და ახალი დნმ-პოლიმერაზა ჯაჭვის სინთეზის დროს ფლუორესცენტური მოლეკულები გაერთიანებულია dsDNA-ის მცირე ღარში და ასხივებენ ფლუორესცენციას.PCR ციკლების რაოდენობის მატებასთან ერთად, უფრო და უფრო მეტი საღებავი ერწყმის dsDNA-ს და ფლუორესცენტური სიგნალი ასევე მუდმივად ძლიერდება.მაგალითისთვის მიიღეთ SYBR Green Ⅰ.
გამოკვლევის მეთოდი:
Taqman ზონდი არის ყველაზე ხშირად გამოყენებული ჰიდროლიზის ზონდი.ზონდის 5′ ბოლოს არის ფლუორესცენტური ჯგუფი, ჩვეულებრივ FAM.ზონდი თავისთავად არის სამიზნე გენის შემავსებელი თანმიმდევრობა.არის ფლუორესცენტური ჩაქრობის ჯგუფი ფლუოროფორის 3′ ბოლოს.ფლუორესცენტული რეზონანსული ენერგიის გადაცემის პრინციპის მიხედვით (Förster-ის რეზონანსული ენერგიის გადაცემა, FRET), როდესაც მომხსენებელი ფლუორესცენტური ჯგუფი (დონორის ფლუორესცენტური მოლეკულა) და ჩამქრალი ფლუორესცენტური ჯგუფი (მიმღები ფლუორესცენტური მოლეკულა), როდესაც აგზნების სპექტრი გადაფარავს და მანძილი შეიძლება იყოს ძალიან ახლოს მიმღები მოლეკულის ფლუორესცენცია, ხოლო ავტოფლუორესცენცია დასუსტებულია.ამიტომ, PCR რეაქციის დასაწყისში, როდესაც ზონდი თავისუფალი და ხელუხლებელია სისტემაში, მომხსენებელი ფლუორესცენტური ჯგუფი არ გამოსცემს ფლუორესცენციას.ანეილირებისას პრაიმერი და ზონდი აკავშირებს შაბლონს.გაფართოების ეტაპზე პოლიმერაზა მუდმივად ასინთეზებს ახალ ჯაჭვებს.დნმ პოლიმერაზას აქვს 5'-3' ეგზონუკლეაზური აქტივობა.ზონდთან მიღწევისას დნმ პოლიმერაზა ჰიდროლიზებს ზონდს შაბლონიდან, გამოყოფს რეპორტიორის ფლუორესცენტულ ჯგუფს ჩამქრალი ფლუორესცენტური ჯგუფისგან და გამოყოფს ფლუორესცენტულ სიგნალს.იმის გამო, რომ ზონდსა და შაბლონს შორის არსებობს ერთი-ერთზე კავშირი, ზონდის მეთოდი ტესტის სიზუსტითა და მგრძნობელობით აღემატება საღებავის მეთოდს.

ნახ 1 qRT-PCR-ის პრინციპი

პრაიმერის დიზაინი
პრინციპები:

პრაიმერები უნდა იყოს შემუშავებული ნუკლეინის მჟავების სერიის კონსერვაციულ რეგიონში და ჰქონდეს სპეციფიკა.

უმჯობესია გამოიყენოთ cDNA თანმიმდევრობა, ასევე მისაღებია mRNA თანმიმდევრობა.თუ არა, გაარკვიეთ დნმ-ის მიმდევრობის cds რეგიონის დიზაინი.
ფლუორესცენტური რაოდენობრივი პროდუქტის სიგრძეა 80-150 bp, ყველაზე გრძელი არის 300 bp, პრაიმერის სიგრძე ზოგადად 17-25 ფუძეს შორისაა და სხვაობა ზემოთ და ქვედა დინების პრაიმერებს შორის არ უნდა იყოს ძალიან დიდი.

G+C შემცველობა 40%-დან 60%-მდეა, ხოლო 45-55% საუკეთესოა.
TM მნიშვნელობა არის 58-62 გრადუსს შორის.
შეეცადეთ თავიდან აიცილოთ პრაიმერის დიმერები და თვითდიმერები, (არ გამოჩნდეს ზედიზედ 4 წყვილზე მეტი დამატებითი ფუძე) თმის სამაგრის სტრუქტურა, თუ ეს გარდაუვალია, გააკეთე ΔG<4,5 კჯ/მოლი* თუ ვერ დარწმუნდებით, რომ gDNA ამოღებულ იქნა საპირისპირო ტრანსკრიფციის დროს სუფთა, უმჯობესია შეიმუშაოთ პრაიმერები *3, ბოლო, T-ის მოდიფიცირებული, დაბოლოება, რათა თავიდან იქნას აცილებული. /C, A/G უწყვეტი სტრუქტურის (2-3) პრაიმერი და არა
სპეციფიკური ჰეტეროგენულად გაძლიერებული თანმიმდევრობის ჰომოლოგია სასურველია იყოს 70%-ზე ნაკლები ან აქვს 8 დამატებითი ბაზის ჰომოლოგია.
Მონაცემთა ბაზა:
CottonFGD ძიება საკვანძო სიტყვებით
პრაიმერის დიზაინი:
IDT-qPCR პრაიმერის დიზაინი

Fig2 IDT ონლაინ პრაიმერის დიზაინის ხელსაწყოს გვერდი

ნახ3 შედეგის გვერდის ჩვენება
lncRNA პრაიმერების დიზაინი:
lncRNA:იგივე საფეხურები, როგორც mRNA.
miRNA:ღეროვანი მარყუჟის მეთოდის პრინციპი: ვინაიდან ყველა miRNA არის მოკლე თანმიმდევრობა დაახლოებით 23 ნტ, პირდაპირი PCR გამოვლენა შეუძლებელია, ამიტომ გამოიყენება ღეროვანი მარყუჟის თანმიმდევრობის ინსტრუმენტი.ღეროვანი მარყუჟის თანმიმდევრობა არის ერთჯაჭვიანი დნმ დაახლოებით 50 ნტ, რომელსაც შეუძლია შექმნას თმის სამაგრი თავისთავად.3 'ბოლო შეიძლება შეიქმნას, როგორც მირნმ-ის ნაწილობრივი ფრაგმენტის შემავსებელი თანმიმდევრობა, შემდეგ სამიზნე miRNA შეიძლება დაუკავშირდეს ღეროვანი მარყუჟის თანმიმდევრობას საპირისპირო ტრანსკრიფციის დროს და მთლიანი სიგრძე შეიძლება მიაღწიოს 70bp-ს, რაც შეესაბამება qPCR-ით განსაზღვრული გაძლიერებული პროდუქტის სიგრძეს.კუდის miRNA პრაიმერის დიზაინი.
გამაძლიერებელი სპეციფიკური გამოვლენა:
ონლაინ აფეთქების მონაცემთა ბაზა: CottonFGD აფეთქება თანმიმდევრობის მსგავსებით
ლოკალური აფეთქება: იხილეთ Blast+-ის გამოყენება ლოკალური აფეთქების გასაკეთებლად, Linux-ს და macos-ს შეუძლიათ პირდაპირ შექმნან ადგილობრივი მონაცემთა ბაზა, win10 სისტემა ასევე შეიძლება გაკეთდეს ubuntu bash-ის დაყენების შემდეგ.შექმენით ადგილობრივი აფეთქების მონაცემთა ბაზა და ლოკალური აფეთქება;გახსენით ubuntu bash win10-ზე.
შენიშვნა: მაღალმთიანი ბამბა და ზღვის კუნძულის ბამბა არის ტეტრაპლოიდური კულტურები, ამიტომ აფეთქების შედეგი ხშირად იქნება ორი ან მეტი მატჩი.წარსულში, NAU CD-ების, როგორც მონაცემთა ბაზის გამოყენება აფეთქების შესასრულებლად, სავარაუდოდ იპოვის ორ ჰომოლოგიურ გენს მხოლოდ რამდენიმე SNP განსხვავებებით.ჩვეულებრივ, ორი ჰომოლოგიური გენი არ შეიძლება განცალკევდეს პრაიმერის დიზაინით, ამიტომ ისინი ერთნაირად განიხილება.თუ აშკარა ინდელია, პრაიმერი, როგორც წესი, შექმნილია ინდელზე, მაგრამ ამან შეიძლება გამოიწვიოს პრაიმერის მეორადი სტრუქტურა. თავისუფალი ენერგია უფრო მაღალი ხდება, რაც იწვევს გაძლიერების ეფექტურობის შემცირებას, მაგრამ ეს გარდაუვალია.

პრაიმერის მეორადი სტრუქტურის გამოვლენა:
ნაბიჯები:გახსნა ოლიგო 7 → შეყვანის შაბლონის თანმიმდევრობა → ქვეფანჯრის დახურვა → შენახვა → პრაიმერის განთავსება შაბლონზე, დააჭირეთ ctrl+D პრაიმერის სიგრძის დასაყენებლად → გაანალიზეთ სხვადასხვა მეორადი სტრუქტურები, როგორიცაა თვითდიმერიზაციის სხეული, ჰეტეროდიმერი, თმის სამაგრი, შეუსაბამობა და ა.შ. ბოლო ორი სურათი სურათზე 4 არის პრაიმერის ტესტის შედეგებიწინა პრაიმერის შედეგი კარგია, არ არის აშკარა დიმერი და თმის სამაგრი სტრუქტურა, არ არის უწყვეტი დამატებითი ფუძეები და თავისუფალი ენერგიის აბსოლუტური მნიშვნელობა 4,5-ზე ნაკლებია, ხოლო უკანა პრაიმერი აჩვენებს უწყვეტს.გარდა ამისა, უფრო სერიოზული დიმერი ჩნდება 3′ ბოლოზე და ჩნდება 4 ზედიზედ ფუძის დიმერი.მიუხედავად იმისა, რომ თავისუფალი ენერგია არ არის მაღალი, 3' დიმერმა Chl შეიძლება სერიოზულად იმოქმედოს გამაძლიერებლობის სპეციფიკასა და გაძლიერების ეფექტურობაზე.გარდა ამისა, აუცილებელია შემოწმდეს თმის სამაგრები, ჰეტეროდიმერები და შეუსაბამობები.

Fig3 oligo7 გამოვლენის შედეგები
გაძლიერების ეფექტურობის გამოვლენა:
PCR რეაქციის ამპლიფიკაციის ეფექტურობა სერიოზულად მოქმედებს PCR შედეგებზე.ასევე qRT-PCR-ში, გაძლიერების ეფექტურობა განსაკუთრებით მნიშვნელოვანია რაოდენობრივი შედეგებისთვის.ამოიღეთ სხვა ნივთიერებები, მანქანები და პროტოკოლები რეაქციის ბუფერში.პრაიმერების ხარისხი ასევე დიდ გავლენას ახდენს qRT-PCR-ის ამპლიფიკაციის ეფექტურობაზე.შედეგების სიზუსტის უზრუნველსაყოფად, როგორც ფარდობითი ფლუორესცენციის რაოდენობრივი, ასევე აბსოლუტური ფლუორესცენციის რაოდენობრივი განსაზღვრა საჭიროა პრაიმერების გაძლიერების ეფექტურობის გამოვლენა.აღიარებულია, რომ ეფექტური qRT-PCR გაძლიერების ეფექტურობა არის 85%-დან 115%-მდე.არსებობს ორი მეთოდი:
1. სტანდარტული მრუდის მეთოდი:
ა.შეურიეთ cDNA
ბ.გრადიენტური განზავება
c.qPCR
დ.ხაზოვანი რეგრესიის განტოლება გაძლიერების ეფექტურობის გამოსათვლელად
2. LinRegPCR
LinRegPCR არის პროგრამა რეალურ დროში RT-PCR მონაცემთა ანალიზისთვის, რომელსაც ასევე უწოდებენ რაოდენობრივ PCR (qPCR) მონაცემებს SYBR Green ან მსგავსი ქიმიის საფუძველზე.პროგრამა იყენებს არასაბაზისო შესწორებულ მონაცემებს, ახორციელებს საბაზისო კორექტირებას თითოეულ ნიმუშზე ცალ-ცალკე, განსაზღვრავს წრფივობის ფანჯარას და შემდეგ იყენებს წრფივ რეგრესიის ანალიზს PCR მონაცემთა ნაკრების სწორ ხაზში დასაყენებლად.ამ ხაზის ფერდობიდან გამოითვლება თითოეული ცალკეული ნიმუშის PCR ეფექტურობა.PCR-ის საშუალო ეფექტურობა თითო ამპლიკონზე და Ct-ის მნიშვნელობა თითო ნიმუშზე გამოიყენება საწყისი კონცენტრაციის გამოსათვლელად თითო ნიმუშზე, გამოხატული თვითნებური ფლუორესცენციის ერთეულებში.მონაცემთა შეყვანა და გამომავალი ხდება Excel-ის ცხრილის მეშვეობით.მხოლოდ ნიმუში
შერევა საჭიროა, გრადიენტის გარეშე
საჭიროა ნაბიჯები:(მაგალითად აიღეთ Bole CFX96, არც თუ ისე მთლად მანქანა ნათელი ABI-ით)
ექსპერიმენტი:ეს არის სტანდარტული qPCR ექსპერიმენტი.
qPCR მონაცემთა გამომავალი:LinRegPCR-ს შეუძლია ამოიცნოს გამომავალი ფაილების ორი ფორმა: RDML ან რაოდენობრივი გაძლიერების შედეგი.სინამდვილეში, ეს არის მანქანის მიერ ციკლის ნომრისა და ფლუორესცენციის სიგნალის რეალურ დროში გამოვლენის მნიშვნელობა, ხოლო გაძლიერება მიიღება ხაზოვანი სეგმენტის ეფექტურობის ფლუორესცენციის ცვლილების მნიშვნელობის ანალიზით.
მონაცემთა შერჩევა: თეორიულად, RDML მნიშვნელობა უნდა იყოს გამოსაყენებელი.ვარაუდობენ, რომ ჩემი კომპიუტერის პრობლემა არის ის, რომ პროგრამული უზრუნველყოფა ვერ ცნობს RDML, ამიტომ მე მაქვს ექსელის გამომავალი მნიშვნელობა, როგორც ორიგინალური მონაცემები.რეკომენდირებულია ჯერ მონაცემების უხეში სკრინინგის ჩატარება, როგორიცაა ნიმუშების დამატების წარუმატებლობა და ა.შ. პუნქტები შეიძლება წაიშალოს გამომავალ მონაცემებში (რა თქმა უნდა, თქვენ არ შეგიძლიათ მათი წაშლა, LinRegPCR უგულებელყოფს ამ პუნქტებს მოგვიანებით ეტაპზე)

Fig5 qPCR მონაცემთა ექსპორტი

ნახ6 კანდიდატის ნიმუშების შერჩევა

მონაცემთა შეყვანა:გახსენით კვალიფიკაციის გაძლიერების results.xls, → გახსენით LinRegPCR → ფაილი → წაიკითხეთ Excel-დან → აირჩიეთ პარამეტრები, როგორც ნაჩვენებია ნახაზზე 7 → OK → დააწკაპუნეთ საბაზისო ხაზების განსაზღვრაზე

Fig7 linRegPCR მონაცემთა შეყვანის საფეხურები

შედეგი:თუ არ არის გამეორება, არ არის საჭირო დაჯგუფება.თუ არის გამეორება, დაჯგუფების რედაქტირება შესაძლებელია ნიმუშის ჯგუფში და გენის სახელი შეიტანება იდენტიფიკატორში და შემდეგ იგივე გენი ავტომატურად დაჯგუფდება.ბოლოს დააწკაპუნეთ ფაილზე, ექსპორტზე ექსპორტზე და იხილეთ შედეგები.ნაჩვენები იქნება თითოეული ჭაბურღილის გაძლიერების ეფექტურობა და R2 შედეგები.მეორეც, თუ დაყოფთ ჯგუფებად, გამოჩნდება შესწორებული საშუალო გამაძლიერებელი ეფექტურობა.დარწმუნდით, რომ თითოეული პრაიმერის გამაძლიერებელი ეფექტურობა 85%-დან 115%-მდეა.თუ ის ძალიან დიდია ან ძალიან პატარა, ეს ნიშნავს, რომ პრაიმერის გამაძლიერებელი ეფექტურობა დაბალია.

ნახ 8 შედეგი და მონაცემთა გამომავალი

ექსპერიმენტული პროცესი:
რნმ ხარისხის მოთხოვნები:
სიწმინდე:1.72.0 მიუთითებს, რომ შეიძლება იყოს ნარჩენი იზოთიოციანატი.სუფთა ნუკლეინის მჟავა A260/A230 უნდა იყოს დაახლოებით 2 . თუ არის ძლიერი აბსორბცია 230 ნმ-ზე, ეს მიუთითებს, რომ არსებობს ორგანული ნაერთები, როგორიცაა ფენატის იონები.გარდა ამისა, მისი აღმოჩენა შესაძლებელია 1,5% აგაროზის გელის ელექტროფორეზით.მიუთითეთ მარკერი, რადგან ssRNA-ს არ აქვს დენატურაცია და მოლეკულური წონის ლოგარითმს არ აქვს წრფივი კავშირი და მოლეკულური წონა არ შეიძლება იყოს სწორად გამოხატული.კონცენტრაცია: თეორიულადარა100ნგ/ულ-ზე ნაკლები, თუ კონცენტრაცია ძალიან დაბალია, სისუფთავე ზოგადად დაბალია და არა მაღალი

Fig9 რნმ გელი

გარდა ამისა, თუ ნიმუში ძვირფასია და რნმ-ის კონცენტრაცია მაღალია, რეკომენდირებულია მისი ალიკვოტირება ექსტრაქციის შემდეგ და რნმ-ის განზავება საბოლოო კონცენტრაციამდე 100-300ნგ/ულლ საპირისპირო ტრანსკრიფციისთვის.Inსაპირისპირო ტრანსკრიფციის პროცესი, როდესაც mRNA ტრანსკრიბირებულია, ოლიგო (dt) პრაიმერები, რომლებსაც შეუძლიათ სპეციალურად დაუკავშირონ polyA კუდებს, გამოიყენება საპირისპირო ტრანსკრიფციისთვის, ხოლო lncRNA და circRNA იყენებენ შემთხვევით ჰექსამერს (შემთხვევითი 6 mer) პრაიმერებს მთლიანი რნმ-ის საპირისპირო ტრანსკრიფციისთვის miRNA-სთვის, miRNA-სპეციფიკური კისრის რესკრიპტის რევერსიისთვის გამოიყენება.ახლა ბევრმა კომპანიამ გამოუშვა სპეციალური კუდების ნაკრები.ღეროვანი მარყუჟის მეთოდისთვის კუდის მეთოდი უფრო მოსახერხებელი, მაღალი გამტარუნარიანობის და რეაგენტის დამზოგავია, მაგრამ იმავე ოჯახის miRNA-ების განმასხვავებელი ეფექტი არ უნდა იყოს ისეთივე კარგი, როგორც ღეროვანი მარყუჟის მეთოდი.საპირისპირო ტრანსკრიფციის თითოეულ კომპლექტს აქვს მოთხოვნები გენის სპეციფიკური პრაიმერების კონცენტრაციაზე (ღეროვანი მარყუჟები).შიდა მითითება, რომელიც გამოიყენება miRNA-სთვის არის U6.ღერო-მარყუჟის ინვერსიის პროცესში, U6-ის მილი ცალკე უნდა შემობრუნდეს და პირდაპირ დაემატოს U6-ის წინა და უკანა პრაიმერი.როგორც circRNA, ასევე lncRNA-ს შეუძლია გამოიყენოს HKG, როგორც შიდა მითითება.IncDNA გამოვლენა,
თუ რნმ-ის პრობლემა არ არის, cDNA ასევე კარგად უნდა იყოს.თუმცა, თუ ექსპერიმენტის სრულყოფა მიიღწევა, უმჯობესია გამოვიყენოთ შიდა საცნობარო გენი (Reference gene, RG), რომელსაც შეუძლია განასხვავოს gDNA cds-ისგან.საერთოდ, RG არის საშინაო გენი., HKG) როგორც ნაჩვენებია სურათზე 10;იმ დროს მე ვამზადებდი სოიოს შესანახ ცილას და შიდა მითითებად ვიყენებდი აქტინ7 ინტრონებს.ამ პრაიმერის გაძლიერებული ფრაგმენტის ზომა gDNA-ში იყო 452bp, ხოლო თუ cDNA გამოიყენებოდა შაბლონად, ეს იყო 142bp.შემდეგ ტესტის შედეგებმა დაადგინა, რომ cDNA-ს ნაწილი რეალურად იყო დაბინძურებული gDNA-ით და ასევე დადასტურდა, რომ არ იყო პრობლემა საპირისპირო ტრანსკრიფციის შედეგთან დაკავშირებით და ის შეიძლება გამოეყენებინათ PCR-ის შაბლონად.უსარგებლოა აგაროზის გელის ელექტროფორეზის ჩატარება უშუალოდ cDNA-ით და ეს არის დიფუზური ზოლი, რაც არ არის დამაჯერებელი.

სურ 10 cDNA-ს გამოვლენა

qPCR პირობების განსაზღვრაზოგადად არ არის პრობლემა ნაკრების პროტოკოლის მიხედვით, ძირითადად tm მნიშვნელობის საფეხურზე.თუ ზოგიერთი პრაიმერი კარგად არ არის დაპროექტებული პრაიმერის დიზაინის დროს, რაც იწვევს დიდ განსხვავებას tm მნიშვნელობასა და თეორიულ 60°C-ს შორის, რეკომენდირებულია, რომ cDNA ნიმუშების შერევის შემდეგ ჩაატაროს გრადიენტური PCR პრაიმერებით და შეეცადეთ თავიდან აიცილოთ ტემპერატურის დაყენება ზოლების გარეშე, როგორც TM მნიშვნელობა.

Მონაცემთა ანალიზი

ჩვეულებრივი ფარდობითი ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR დამუშავების მეთოდი ძირითადად 2-ის მიხედვითაა-ΔΔCT.მონაცემთა დამუშავების შაბლონი.

Მსგავსი პროდუქტები:

რეალურ დროში PCR მარტივია^TM – თაყმანი

რეალურ დროში PCR მარტივია^TM – SYBR GREN I

RT Easy I (მასტერ პრემიქსი პირველი ჯაჭვის cDNA სინთეზისთვის)

RT Easy II (მასტერ პრემიქსი პირველი ჯაჭვის cDNA სინთეზისთვის qPCR-სთვის)