საწყისი მასალა: რნმ
რაოდენობრივი საპირისპირო ტრანსკრიფცია PCR (RT-qPCR) არის ექსპერიმენტული მეთოდი, რომელიც გამოიყენება PCR ექსპერიმენტებში რნმ-ის გამოყენებით, როგორც საწყისი მასალა.ამ მეთოდით, მთლიანი რნმ ან მესინჯერი რნმ (მრნმ) პირველად გადაიწერება დამატებით დნმ-ში (cDNA) საპირისპირო ტრანსკრიპტაზას მეშვეობით.შემდგომში, qPCR რეაქცია განხორციელდა cDNA-ის გამოყენებით, როგორც შაბლონი.RT-qPCR გამოიყენებოდა მოლეკულური ბიოლოგიის სხვადასხვა აპლიკაციებში, მათ შორის გენის ექსპრესიის ანალიზში, რნმ-ის ინტერფერენციის ვალიდაციაში, მიკროსარეის ვალიდაციაში, პათოგენის გამოვლენაში, გენეტიკური ტესტირებისა და დაავადების კვლევაში.
ერთსაფეხურიანი და ორსაფეხურიანი მეთოდები RT-qPCR-სთვის
RT-qPCR შეიძლება განხორციელდეს ერთსაფეხურიანი ან ორსაფეხურიანი მეთოდით.ერთსაფეხურიანი RT-qPCR აერთიანებს საპირისპირო ტრანსკრიპციას და PCR გაძლიერებას, რაც საშუალებას აძლევს საპირისპირო ტრანსკრიპტაზას და დნმ პოლიმერაზას დაასრულონ რეაქცია იმავე მილში იმავე ბუფერულ პირობებში.ერთსაფეხურიანი RT-qPCR მხოლოდ თანმიმდევრობის სპეციფიკური პრაიმერების გამოყენებას მოითხოვს.ორსაფეხურიანი RT-qPCR-ში, საპირისპირო ტრანსკრიფცია და PCR გაძლიერება ხორციელდება ორ მილში, სხვადასხვა ოპტიმიზებული ბუფერების, რეაქციის პირობებისა და პრაიმერის დიზაინის სტრატეგიების გამოყენებით.
| უპირატესობა | მინუსი | |
| Ერთი ნაბიჯი | ამ მეთოდს აქვს ნაკლები ექსპერიმენტული შეცდომა, რადგან ორივე რეაქცია ერთ მილში ხდება
პიპეტინგის ნაკლები ნაბიჯი ამცირებს დაბინძურების რისკს
ვარგისია მაღალი გამტარუნარიანობის გაძლიერებისთვის/სკრინინგისთვის, სწრაფი და რეპროდუცირებადი | ორსაფეხურიანი რეაქციების ცალკე ოპტიმიზაცია შეუძლებელია
ვინაიდან რეაქციის პირობები კომპრომეტირებულია ორსაფეხურიანი რეაქციის კომბინაციით, მგრძნობელობა არ არის ისეთი კარგი, როგორც ორსაფეხურიანი მეთოდის.
ერთი ნიმუშის მიერ აღმოჩენილი სამიზნეების რაოდენობა მცირეა |
| ორი ნაბიჯი | სტაბილური cDNA ბიბლიოთეკების შექმნის შესაძლებლობა, რომლებიც შეიძლება ინახებოდეს დიდი ხნის განმავლობაში და გამოიყენონ მრავალ რეაქციაში
სამიზნე გენები და საცნობარო გენები შეიძლება გაძლიერდეს იმავე cDNA ბიბლიოთეკიდან მრავალი cDNA ბიბლიოთეკის საჭიროების გარეშე
რეაქციის ბუფერები და რეაქციის პირობები, რომლებიც იძლევა ერთჯერადი რეაქციის ოპტიმიზაციის საშუალებას
ტრიგერის პირობების მოქნილი შერჩევა | მრავალი მილის გამოყენება და მეტი პიპეტინგის საფეხურები ზრდის დნმ-ის დაბინძურების რისკს, და შრომატევადი.
მოითხოვს უფრო მეტ ოპტიმიზაციას, ვიდრე ერთსაფეხურიანი მეთოდი |
Მსგავსი პროდუქტები:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (ერთი ნაბიჯი)-SYBR მწვანე I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (ერთი ნაბიჯი)-Taqman
RT Easyᵀᴹ I Master Premix პირველი რიგის CDNA სინთეზისთვის
რეალურ დროში PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
რეალურ დროში PCR Easyᵀᴹ-Taqman
მთლიანი რნმ-ისა და mRNA-ს შერჩევა
RT-qPCR ექსპერიმენტის შემუშავებისას მნიშვნელოვანია გადაწყვიტოს, გამოიყენო მთლიანი რნმ თუ გაწმენდილი mRNA, როგორც შაბლონი საპირისპირო ტრანსკრიფციისთვის.მიუხედავად იმისა, რომ mRNA-ს შეუძლია ოდნავ უფრო მაღალი მგრძნობელობის უზრუნველყოფა, მთლიანი რნმ მაინც ხშირად გამოიყენება.ამის მიზეზი ის არის, რომ მთლიან რნმ-ს აქვს უფრო მნიშვნელოვანი უპირატესობა, როგორც საწყისი მასალა, ვიდრე mRNA.უპირველეს ყოვლისა, პროცესი მოითხოვს გაწმენდის ნაკლებ ნაბიჯებს, რაც უზრუნველყოფს შაბლონის უკეთეს რაოდენობრივ აღდგენას და შედეგების უკეთეს ნორმალიზებას უჯრედების დაწყების ნომრებზე.მეორეც, ის თავიდან აიცილებს mRNA გამდიდრების საფეხურს, რაც თავიდან აიცილებს არასწორ შედეგებს სხვადასხვა mRNA-ების სხვადასხვა აღდგენის გამო.მთლიანობაში, ვინაიდან უმეტეს აპლიკაციებში სამიზნე გენის ფარდობითი რაოდენობრივი განსაზღვრა უფრო მნიშვნელოვანია, ვიდრე გამოვლენის აბსოლუტური მგრძნობელობა, საერთო რნმ უმეტეს შემთხვევაში უფრო შესაფერისია.
საპირისპირო ტრანსკრიფციის პრაიმერი
ორსაფეხურიან მეთოდში, სამი განსხვავებული მეთოდი შეიძლება გამოყენებულ იქნას cDNA რეაქციის დასამზადებლად: ოლიგო(dT) პრაიმერები, შემთხვევითი პრაიმერები ან თანმიმდევრობის სპეციფიკური პრაიმერები.როგორც წესი, ოლიგო(dT) პრაიმერები და შემთხვევითი პრაიმერები გამოიყენება კომბინაციაში.ეს პრაიმერები ანელებენ შაბლონის mRNA ჯაჭვს და უზრუნველყოფენ საპირისპირო ტრანსკრიპტაზას სინთეზის საწყისი წერტილით.
| პრაიმერის შერჩევა | სტრუქტურა და ფუნქცია | უპირატესობა | მინუსი |
| ოლიგო(dT) პრაიმერი (ან დამაგრებული ოლიგო(dT) პრაიმერი) | გაფართოებული ანილირება თიმინის ნარჩენებზე mRNA-ს პოლი(A) კუდზე;წამყვანმა ოლიგო(dT) პრაიმერი შეიცავს G, C ან A-ს 3' ბოლოზე (ანკერის ადგილი) | სრული სიგრძის cDNA-ს სინთეზი პოლი(A)-კუდიანი mRNA-დან
გამოიყენება, როდესაც ნაკლები საწყისი მასალაა ხელმისაწვდომი
დამაგრების ადგილი უზრუნველყოფს ოლიგო(dT) პრაიმერის მიბმას mRNA-ის 5' პოლი(A) კუდთან | შესაფერისია მხოლოდ პოლი(A) კუდის მქონე გენების გასაძლიერებლად
მიიღეთ cDNA შეკვეცილი პრაიმინგის ადგილიდან*2 პოლი(A)-ში
მიკერძოებული მიბმული 3′ ბოლომდე*
*ეს შესაძლებლობა მინიმუმამდეა დაყვანილი, თუ გამოყენებული იქნება დამაგრებული ოლიგო(dT) პრაიმერები |
| შემთხვევითი პრაიმერი
| 6-დან 9-მდე ფუძის სიგრძით, რომელსაც შეუძლია რნმ-ის ტრანსკრიპციის დროს რამდენიმე უბნის ანელება | ანელება ყველა რნმ-ზე (tRNA, rRNA და mRNA)
ვარგისია მნიშვნელოვანი მეორადი სტრუქტურის მქონე ტრანსკრიპტებისთვის ან როცა ნაკლები საწყისი მასალაა ხელმისაწვდომი
cDNA-ს მაღალი გამოსავლიანობა | cDNA ხდება საპირისპირო ტრანსკრიბცია ყველა რნმ-დან, რაც, როგორც წესი, არ არის სასურველი და შეიძლება განზავდეს სამიზნე mRNA-ს სიგნალი
მიიღეთ შეკვეცილი cDNA |
| თანმიმდევრობის სპეციფიკური პრაიმერები | მორგებული პრაიმერები, რომლებიც მიზნად ისახავს mRNA სპეციფიკურ თანმიმდევრობებს | სპეციფიკური cDNA ბიბლიოთეკა
მგრძნობელობის გაუმჯობესება
საპირისპირო qPCR პრაიმერების გამოყენება | შემოიფარგლება მხოლოდ ერთი სამიზნე გენის სინთეზით |
საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა
საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა არის ფერმენტი, რომელიც იყენებს რნმ-ს დნმ-ის სინთეზისთვის.ზოგიერთ საპირისპირო ტრანსკრიპტაზას აქვს RNase აქტივობა და შეუძლია დაშალოს რნმ-ის ჯაჭვები რნმ-დნმ-ის ჰიბრიდულ ჯაჭვებში ტრანსკრიპციის შემდეგ.თუ მას არ აქვს RNase ფერმენტული აქტივობა, RNaseH შეიძლება დაემატოს qPCR უფრო მაღალი ეფექტურობისთვის.ხშირად გამოყენებული ფერმენტები მოიცავს მოლონის თაგვის ლეიკემიის ვირუსის უკუ ტრანსკრიპტაზას და ფრინველის მიელობლასტომის ვირუსის უკუ ტრანსკრიპტაზას.RT-qPCR-სთვის იდეალურია აირჩიონ საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა უფრო მაღალი თერმდგრადობით, რათა cDNA სინთეზი განხორციელდეს მაღალ ტემპერატურაზე, რაც უზრუნველყოფს მაღალი მეორადი სტრუქტურის მქონე რნმ-ების წარმატებულ ტრანსკრიფციას, ხოლო მათი სრული აქტივობის შენარჩუნებას მთელი რეაქციის განმავლობაში, რაც იწვევს cDNA-ს უფრო მაღალ გამომუშავებას.
Მსგავსი პროდუქტები:
Foreasy M-MLV საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა
საპირისპირო ტრანსკრიპტაზას RNase H აქტივობა
RNaseH-ს შეუძლია რნმ-ის ჯაჭვების დაშლა რნმ-დნმ-ის დუპლექსებიდან, რაც იძლევა ორჯაჭვიანი დნმ-ის ეფექტური სინთეზის საშუალებას.თუმცა, ხანგრძლივი mRNA-ს შაბლონად გამოყენებისას, რნმ შეიძლება ნაადრევად დაიშალა, რის შედეგადაც cDNA-ს შეკვეცა.ამიტომ, ხშირად სასარგებლოა RNaseH აქტივობის მინიმუმამდე შემცირება cDNA კლონირების დროს, თუ სასურველია გრძელი ტრანსკრიპტების სინთეზი.ამის საპირისპიროდ, რევერსიული ტრანსკრიპტაზები RNase H აქტივობით ხშირად სასარგებლოა qPCR გამოყენებისთვის, რადგან ისინი აძლიერებენ რნმ-დნმ-ის დუპლექსების დნობას PCR-ის პირველი ციკლის განმავლობაში.
პრაიმერის დიზაინი
RT-qPCR-ში qPCR საფეხურისთვის გამოყენებული PCR პრაიმერები იდეალურად უნდა იყოს შემუშავებული ეგზონ-ეგზონის შეერთებაზე, სადაც გამაძლიერებელი პრაიმერი პოტენციურად შეიძლება გაფართოვდეს რეალურ ეგზონ-ინტრონის საზღვარზე.ვინაიდან ინტრონის შემცველი გენომიური დნმ-ის თანმიმდევრობები არ არის გაძლიერებული, ეს დიზაინი ამცირებს ცრუ პოზიტივის რისკს, რომელიც გაძლიერებულია გენომიური დნმ-ის დაბინძურებისგან.
თუ პრაიმერების დაპროექტება შეუძლებელია ეგზონების ან ეგზონ-ეგზონის საზღვრების გამოსაყოფად, შესაძლოა საჭირო გახდეს რნმ-ის ნიმუშების დამუშავება RNase-ის თავისუფალი DNase I-ით ან dsDNase-ით გენომიური დნმ-ის დაბინძურების მოსაშორებლად.
RT-qPCR კონტროლი
საპირისპირო ტრანსკრიპციის უარყოფითი კონტროლი (-RT კონტროლი) უნდა იყოს ჩართული ყველა RT-qPCR ექსპერიმენტში დნმ-ის დაბინძურების გამოსავლენად (როგორიცაა გენომიური დნმ ან PCR პროდუქტები წინა რეაქციებიდან).ეს კონტროლი შეიცავს ყველა რეაქციის კომპონენტს, გარდა საპირისპირო ტრანსკრიპტაზასა.ვინაიდან საპირისპირო ტრანსკრიფცია არ ხდება ამ კონტროლით, თუ PCR გაძლიერება შეინიშნება, დნმ-დან დაბინძურება დიდი ალბათობით.
გამოქვეყნების დრო: აგვისტო-02-2022
