პიპეტის წვერების და EP მილების სტერილიზაცია და ა.შ.
1. მოამზადეთ 0,1% (მეათასედი) DEPC (მაღალი ტოქსიკური ნივთიერება) დეიონიზებული წყლით, გამოიყენეთ იგი ფრთხილად კვამლის გამწოვში და შეინახეთ 4°C-ზე სინათლისგან დაშორებით;
DEPC წყალი არის სუფთა წყალი, რომელიც დამუშავებულია DEPC-ით და სტერილიზებულია მაღალი ტემპერატურისა და მაღალი წნევით.ტესტირებულია, რომ არ იყოს RNase, DNase და პროტეინაზა.
2. ჩადეთ პიპეტის წვერი და EP მილაკი 0.1% DEPC-ში და დარწმუნდით, რომ პიპეტის წვერი და EP მილი შევსებულია 0.1% DEP-ით.
3. დაიცავით სინათლისგან, გააჩერეთ ღამით (12-24სთ)
4. ყუთს, რომელიც შეიცავს წვეროს და EP მილს, არ საჭიროებს DEPC-ში გაჟღენთვას.DEPC წყლის წვერში ან EP მილში უხეშად ამოღების შემდეგ, შეფუთეთ და შეფუთეთ.
5. 121 გრადუსი ცელსიუსი, 30 წთ
6. 180 გრადუს ცელსიუსზე, გაშრობა რამდენიმე საათის განმავლობაში (მინიმუმ 3 საათი)
შენიშვნა: ა.ატარეთ ლატექსის ხელთათმანები და ნიღბები DEPC-თან მუშაობისას!b, ან DEPC სტერილიზაციის გარეშე, 130 ℃, 90 წუთი ავტოკლავი (ბევრი ლაბორატორიის მაღალი ტემპერატურის სტერილიზაცია ორჯერ)
რნმ-ის ექსტრაქციის მოსაზრებები
ქსოვილის რნმ-ის იზოლაციის უკმარისობის ორი ძირითადი ფენომენი
რნმ-ის დეგრადაცია და მინარევების ნარჩენები ქსოვილებში,რაც შეეხება დეგრადაციას, მოდი ჯერ გადავხედოთ, რატომ არ იშლება კულტივირებული უჯრედებიდან ამოღებული რნმ.არსებული რნმ-ის ექსტრაქციის რეაგენტები შეიცავს კომპონენტებს, რომლებიც სწრაფად აინჰიბირებენ RNase-ს.დაამატეთ ლიზატი კულტივირებულ უჯრედებს და უბრალოდ აურიეთ, ყველა უჯრედი შეიძლება საფუძვლიანად იყოს შერეული ლიზატთან და უჯრედები მთლიანად ლიზდება.უჯრედების ლიზისის შემდეგ, ლიზატის აქტიური ინგრედიენტები დაუყოვნებლივ თრგუნავენ უჯრედშიდა RNase-ს, ამიტომ რნმ ხელუხლებელი რჩება.ანუ იმის გამო, რომ კულტივირებული უჯრედები ადვილად და სრულად უკავშირდება ლიზატს, მათი რნმ ადვილად არ იშლება;მეორეს მხრივ, ქსოვილში არსებული რნმ ადვილად იშლება, რადგან ქსოვილში არსებული უჯრედები არ არის ადვილი სწრაფად დაუკავშირდნენ ლიზატს.საკმარისი კონტაქტის გამო.Ისე,თუ ვივარაუდებთ, რომ არსებობს გზა ქსოვილის ერთ უჯრედად გადაქცევის რნმ-ის აქტივობის დათრგუნვისას, დეგრადაციის პრობლემა შეიძლება მთლიანად მოგვარდეს.
თხევადი აზოტის დაფქვა ყველაზე ეფექტური ასეთი მეთოდია.თუმცა, თხევადი აზოტის დაფქვის მეთოდი ძალიან პრობლემურია, განსაკუთრებით მაშინ, როდესაც ნიმუშების რაოდენობა დიდია.ამან გამოიწვია შემდეგი საუკეთესო რამ: ჰომოგენიზატორი.Theჰომოგენიზატორიმეთოდი არ განიხილავს საკითხს იმის შესახებ, თუ როგორ ხდება RNase აქტივობის დათრგუნვა უჯრედებთან ლიზატთან კონტაქტის დაწყებამდე, არამედ ლოცულობს, რომ ქსოვილის დარღვევის სიჩქარე იყოს უფრო სწრაფი, ვიდრე უჯრედშიდა RNase RN-ის დეგრადაციის სიჩქარე.
ელექტრო ჰომოგენიზატორის ეფექტი უკეთესია,და მინის ჰომოგენიზატორის ეფექტი ცუდია, მაგრამ ზოგადად, ჰომოგენიზატორის მეთოდი ვერ აფერხებს დეგრადაციის ფენომენს.ამიტომ, თუ ექსტრაქცია დეგრადირებულია, ორიგინალური ელექტრო ჰომოგენიზატორი უნდა იქნას გამოყენებული თხევადი აზოტით დასაფქვავად;ორიგინალური მინის ჰომოგენიზატორი უნდა შეიცვალოს ელექტრო ჰომოგენიზატორით ან პირდაპირ დაფქული თხევადი აზოტით.პრობლემა თითქმის 100%-ით შესაძლებელია.გადაწყდეს.
მინარევების ნარჩენების პრობლემას, რომელიც გავლენას ახდენს შემდგომ ექსპერიმენტებზე, უფრო მრავალფეროვანი მიზეზები აქვს, ვიდრე დეგრადაცია, და გადაწყვეტილებებიც შესაბამისად განსხვავებულია.Საბოლოოდ,თუ ქსოვილში არის დეგრადაცია ან ნარჩენი მინარევები, უნდა იყოს ოპტიმიზირებული ექსტრაქციის მეთოდი/რეაგენტი კონკრეტული ექსპერიმენტული მასალისთვის.თქვენ არ გჭირდებათ თქვენი ძვირფასი ნიმუშების გამოყენება ოპტიმიზაციისთვის: შეგიძლიათ შეიძინოთ რამდენიმე პატარა ცხოველი, როგორიცაა თევზი/ქათამი ბაზრიდან, აიღოთ მასალის შესაბამისი ნაწილი რნმ-ის ექსტრაქციისთვის, ხოლო მეორე ნაწილი ცილის ექსტრაქციისთვის - დაფქვით პირით, კუჭისა და ნაწლავების ექსტრაქტით.
მოპოვებული რნმ-ის სამიზნე რნმ გამოიყენება სხვადასხვა შემდგომი ექსპერიმენტებისთვის და მისი ხარისხის მოთხოვნები განსხვავებულია
cDNA ბიბლიოთეკის მშენებლობა მოითხოვს რნმ მთლიანობას ფერმენტული რეაქციის ინჰიბიტორების ნარჩენების გარეშე;ჩრდილოეთი მოითხოვს რნმ-ის უფრო მაღალ მთლიანობას და ქვედა მოთხოვნებს ფერმენტული რეაქციის ინჰიბიტორების ნარჩენებზე;RT-PCR არ საჭიროებს ძალიან მაღალ რნმ მთლიანობას,მაგრამ აფერხებს ფერმენტულ რეაქციებს.ნარჩენების მოთხოვნები მკაცრია.შეყვანა განსაზღვრავს გამომავალს;ყოველთვის, როცა მიზანი არის უმაღლესი სისუფთავის რნმ-ის მიღება, ეს ხალხს და ფულს დაუჯდება.
ნიმუშების შეგროვება/შენახვა
დეგრადაციაზე მოქმედი ფაქტორები მას შემდეგ, რაც ნიმუში ტოვებს ცოცხალ სხეულს/ან ზრდის თავდაპირველ გარემოს, ნიმუშში არსებული ენდოგენური ფერმენტები დაიწყებენ რნმ-ის დეგრადაციას,ხოლო დეგრადაციის სიჩქარე დაკავშირებულია ენდოგენური ფერმენტების შემცველობასთან და ტემპერატურასთან.ტრადიციულად, ენდოგენური ფერმენტის აქტივობის სრულად დათრგუნვის მხოლოდ ორი გზა არსებობს: დაუყონებლივ დაამატეთ ლიზატი და ჰომოგენიზაცია საფუძვლიანად და სწრაფად;დავჭრათ წვრილად და დაუყოვნებლივ გავყინოთ თხევად აზოტში.ორივე მიდგომა მოითხოვს სწრაფ ოპერაციას.ეს უკანასკნელი შესაფერისია ყველა ნიმუშისთვის, ხოლო პირველი განკუთვნილია მხოლოდ ქსოვილებისთვის, რომლებსაც აქვთ უჯრედების დაბალი შემცველობა და ენდოგენური ფერმენტები და ადვილად ჰომოგენიზაცია.კერძოდ, მცენარეული ქსოვილი, ღვიძლი, თიმუსი, პანკრეასი, ელენთა, ტვინი, ცხიმი, კუნთოვანი ქსოვილი და ა.შ. უმჯობესია გაყინოთ თხევადი აზოტით სანამ გააგრძელებთ.
ნიმუშების ფრაგმენტაცია და ჰომოგენიზაცია
დეგრადაციაზე და მოსავლიანობაზე მოქმედი ფაქტორები ნიმუშის ფრაგმენტაცია არისსაფუძვლიანი ჰომოგენიზაციისთვის, რომელიც არის რნმ-ის სრული და სრული განთავისუფლებისთვის.უჯრედები შეიძლება პირდაპირ ჰომოგენიზირებული იყოს გატეხვის გარეშე.ქსოვილების ჰომოგენიზაცია შესაძლებელია მხოლოდ გატეხვის შემდეგ.საფუარი და ბაქტერიები უნდა დაინგრეს შესაბამისი ფერმენტებით, სანამ ისინი ჰომოგენიზდებიან.ქვედა ენდოგენური ფერმენტის შემცველობით და უფრო მარტივი ჰომოგენიზაციის მქონე ქსოვილები შეიძლება დაქუცმაცდეს და ჰომოგენიზდეს ერთჯერად ლიზატში ჰომოგენიზატორით;მცენარეული ქსოვილი, ღვიძლი, თიმუსი, პანკრეასი, ელენთა, ტვინი, ცხიმი, კუნთოვანი ქსოვილი და სხვა ნიმუშები, ისინი ან მაღალია ენდოგენური ფერმენტების შემცველობით ან ადვილად არ ჰომოგენიზდებიან,ამიტომ ქსოვილის მოშლა და ჰომოგენიზაცია ცალკე უნდა განხორციელდეს.ფრაგმენტაციის ყველაზე საიმედო და პროდუქტიული მეთოდია თხევადი აზოტით დაფქვა, ხოლო ჰომოგენიზაციის ყველაზე საიმედო მეთოდი ელექტრო ჰომოგენიზატორის გამოყენებაა.განსაკუთრებული შენიშვნა თხევადი აზოტით დაფქვის შესახებ: ნიმუში არ უნდა გაიყინოს დაფქვის მთელი პროცესის განმავლობაში, რადგან ენდოგენური ფერმენტები უფრო მეტად იმოქმედებენ გაყინვისას.
ლიზატის არჩევანი
ზემოქმედება მოქმედების მოხერხებულობაზე და ნარჩენი ენდოგენური მინარევების ფაქტორებზე საყოველთაოდ გამოყენებულ ლიზისურ ხსნარებს შეუძლიათ თითქმის შეაჩერონ RNase-ს აქტივობა.აქედან გამომდინარე, ლიზისის ხსნარის არჩევის მთავარი პუნქტია განხილვა გამწმენდის მეთოდთან ერთად.არის ერთი გამონაკლისი:ნიმუშები მაღალი ენდოგენური ფერმენტების შემცველობით რეკომენდირებულია გამოიყენონ ფენოლის შემცველი ლიზატი, რათა გაიზარდოს ენდოგენური ფერმენტების ინაქტივაციის უნარი.
გაწმენდის მეთოდის არჩევანი
ფაქტორები, რომლებიც გავლენას ახდენენ ნარჩენი ენდოგენური მინარევებისაგან, ექსტრაქციის სიჩქარე სუფთა ნიმუშებისთვის, როგორიცაა უჯრედები, დამაკმაყოფილებელი შედეგების მიღება შესაძლებელია თითქმის ნებისმიერი ხელთ არსებული გაწმენდის მეთოდით.მაგრამ მრავალი სხვა ნიმუშისთვის, განსაკუთრებით მათთვის, ვისაც აქვს მინარევების მაღალი დონე, როგორიცაა მცენარეები, ღვიძლი, ბაქტერიები და ა.შ., გაწმენდის შესაფერისი მეთოდის არჩევა გადამწყვეტია.სვეტის ცენტრიდანული გაწმენდის მეთოდს აქვს ექსტრაქციის სწრაფი სიჩქარე და შეუძლია ეფექტურად ამოიღოს მინარევები, რომლებიც გავლენას ახდენენ რნმ-ის შემდგომ ფერმენტულ რეაქციაზე, მაგრამ ეს ძვირია (Foregene-ს შეუძლია შემოგთავაზოთ ეკონომიური კომპლექტები, მეტი დეტალები დააწკაპუნეთაქ);გაწმენდის ეკონომიური და კლასიკური მეთოდების გამოყენებით, როგორიცაა LiCl ნალექი, ასევე შესაძლებელია დამაკმაყოფილებელი შედეგების მიღება, მაგრამ ოპერაციის დრო გრძელია..
"სამი დისციპლინა და რვა ყურადღება" რნმ-ის ექსტრაქციისთვის
დისციპლინა 1:ბოლო მოეღოს ეგზოგენური ფერმენტების დაბინძურებას.
შენიშვნა 1:მკაცრად ატარეთ ნიღბები და ხელთათმანები.
შენიშვნა 2:ცენტრიფუგის მილები, წვერის თავები, პიპეტის წნელები, ელექტროფორეზის ავზები და ექსპერიმენტში ჩართული საცდელი სკამები კარგად უნდა განადგურდეს.
შენიშვნა 3:ექსპერიმენტში ჩართული რეაგენტები/ხსნარები, განსაკუთრებით წყალი, არ უნდა იყოს RNase-ისგან.
დისციპლინა 2:ბლოკავს ენდოგენური ფერმენტების აქტივობას
შენიშვნა 4:აირჩიეთ შესაბამისი ჰომოგენიზაციის მეთოდი.
შენიშვნა 5:აირჩიეთ შესაბამისი ლიზატი.
შენიშვნა 6:აკონტროლეთ ნიმუშის საწყისი რაოდენობა.
დისციპლინა 3:დააზუსტეთ თქვენი მოპოვების მიზანი
შენიშვნა 7:როდესაც ლიზატის ნებისმიერი სისტემა უახლოვდება ნიმუშის მაქსიმალურ საწყის რაოდენობას, ექსტრაქციის წარმატების მაჩვენებელი მკვეთრად ეცემა.
შენიშვნა 8:რნმ-ის წარმატებული ექსტრაქციის ერთადერთი ეკონომიკური კრიტერიუმი არის წარმატება შემდგომ ექსპერიმენტებში და არა მოსავლიანობა.
RNase დაბინძურების ტოპ 10 წყარო
1. თითები ეგზოგენური ფერმენტების პირველი წყაროა, ამიტომ ხელთათმანები ხშირად უნდა ატაროთ და გამოცვალოთ.გარდა ამისა, აუცილებელია ნიღბების ტარება, რადგან სუნთქვა ასევე ფერმენტების მნიშვნელოვანი წყაროა.ხელთათმანის ნიღბის ტარების დამატებითი უპირატესობა არის ექსპერიმენტატორის დაცვა.
2. პიპეტის წვერები, ცენტრიფუგის მილები, პიპეტები - RNase არ შეიძლება ინაქტივირებული იყოს მხოლოდ სტერილიზაციის გზით, ამიტომ პიპეტის წვერები და ცენტრიფუგის მილები უნდა დამუშავდეს DEPC-ით, მაშინაც კი, თუ ისინი მონიშნულია როგორც DEPC დამუშავებული.უმჯობესია გამოიყენოთ სპეციალური დანიშნულების პიპეტი, გამოყენებამდე გაწურეთ 75%-იანი სპირტიანი ბამბით, განსაკუთრებით ჯოხი;გარდა ამისა, დარწმუნდით, რომ არ გამოიყენოთ თავის მოსაშორებელი.
3. წყალი/ბუფერი არ უნდა იყოს RNase დაბინძურებისგან.
4. ტესტის მაგიდა მაინც უნდა გაიწმინდოს 75%-იანი სპირტიანი ბამბის ბურთულებით.
5. ენდოგენური RNase ყველა ქსოვილი შეიცავს ენდოგენურ ფერმენტებს, ამიტომ ქსოვილების სწრაფი გაყინვა თხევადი აზოტით საუკეთესო საშუალებაა დეგრადაციის შესამცირებლად.თხევადი აზოტის შენახვის/დაფქვის მეთოდი მართლაც მოუხერხებელია, მაგრამ ეს ერთადერთი გზაა ენდოგენური ფერმენტების მაღალი დონის მქონე ქსოვილებისთვის.
6. რნმ-ის ნიმუშები რნმ-ის ექსტრაქციის პროდუქტები შეიძლება შეიცავდეს RNase დაბინძურების კვალს.
7. პლაზმიდის ექსტრაქცია პლაზმიდის ექსტრაქცია ხშირად იყენებს რნაზას რნმ-ის დასაშლელად, ხოლო ნარჩენი რნაზა უნდა დაიჯესტირდეს პროტეინაზა K-ით და გამოიყოს PCI-ით.
8. რნმ-ის შენახვა მაშინაც კი, თუ ის ინახება დაბალ ტემპერატურაზე, რნმ-ის კვალი რაოდენობა გამოიწვევს რნმ-ის დეგრადაციას.რნმ-ის გრძელვადიანი შენარჩუნებისთვის საუკეთესო გამოსავალი არის მარილი/ალკოჰოლური სუსპენზია, რადგან ალკოჰოლი თრგუნავს ყველა ფერმენტულ აქტივობას დაბალ ტემპერატურაზე.
9. როდესაც კათიონები (Ca, Mg) შეიცავს ამ იონებს, 5 წუთის განმავლობაში 80C ტემპერატურაზე გაცხელება გამოიწვევს რნმ-ის დაშლას, ასე რომ, თუ რნმ უნდა გაცხელდეს, კონსერვაციის ხსნარი უნდა შეიცავდეს ქელატირებელ აგენტს (1მმ ნატრიუმის ციტრატი, pH 6.4).
10. შემდგომ ექსპერიმენტებში გამოყენებული ფერმენტები შეიძლება იყოს დაბინძურებული RNase-ით.
10 რჩევა რნმ-ის ექსტრაქციისთვის
1: სწრაფად აღკვეთეთ RNase აქტივობა.ნიმუშები სწრაფად იყინება შეგროვების შემდეგ და RNase ინაქტივირებულია სწრაფი მოქმედებით ლიზისის დროს.
2: აირჩიეთ შესაბამისი ექსტრაქციის მეთოდი ქსოვილისთვის მაღალი რიბოზიმური შემცველობისთვის და ცხიმოვანი ქსოვილი უმჯობესია გამოიყენოთ ფენოლის შემცველი მეთოდი.
3: პროგნოზირების ხარისხი მოითხოვს ჩრდილოეთს, cDNA ბიბლიოთეკის კონსტრუქცია მოითხოვს მაღალ მთლიანობას და RT-PCR და RPA (რიბონუკლეაზას დაცვის ანალიზი) არ საჭიროებს მაღალ მთლიანობას.RT-PCR მოითხოვს მაღალ სისუფთავეს (ფერმენტის ინჰიბიტორის ნარჩენები).
4: საფუძვლიანი ჰომოგენიზაცია არის მოსავლიანობის გაუმჯობესებისა და დეგრადაციის შემცირების გასაღები.
5: შეამოწმეთ რნმ ელექტროფორეზის გამოვლენის მთლიანობა, 28S: 18S = 2: 1 არის სრული ნიშანი, 1: 1 ასევე მისაღებია ექსპერიმენტების უმეტესობისთვის.
6: დნმ-ის მოცილება RT-PCR-სთვის, მასივის ანალიზი უმჯობესია გამოიყენოთ Dnase I დნმ-ის მოსაშორებლად.
7: შეამცირეთ ეგზოგენური ფერმენტების დაბინძურება - ფერმენტების შემოტანა შეუძლებელია გარედან.
8: დაბალი კონცენტრაციის ნუკლეინის მჟავას კონცენტრაციისას უნდა დაემატოს თანაპრეციპიტაციური რეაგენტი.მაგრამ ფერმენტების და დნმ-ის შემცველი თანაპრეციპიტანტის დაბინძურების თავიდან ასაცილებლად.
9: საფუძვლიანად დაითხოვეთ რნმ, საჭიროების შემთხვევაში გააცხელეთ 65C ტემპერატურაზე 5 წუთის განმავლობაში.
შენახვის შესაფერისი მეთოდი
მისი შენახვა შესაძლებელია -20C-ზე მცირე ხნით, ხოლო -80C-ზე დიდი ხნით.პირველი ნაბიჯი რნმ-ის გამოსავლიანობის გასაუმჯობესებლად არის იმის გაცნობიერება, რომ სხვადასხვა ნიმუშებში რნმ-ის შემცველობა მნიშვნელოვნად განსხვავდება.მაღალი სიმრავლე (2-4 მკგ/მგ), როგორიცაა ღვიძლი, პანკრეასი, გული, საშუალო სიმრავლე (0,05-2 მკგ/მგ), როგორიცაა ტვინი, ემბრიონი, თირკმელი, ფილტვები, თიმუსი, საკვერცხე, დაბალი სიმრავლე (<0,05მგ/მგ) მგ), როგორიცაა შარდის ბუშტი, ძვალი, ცხიმი.
1: ლიზის უჯრედები RN-ის გამოსაყოფად – თუ რნმ არ გამოიყოფა, მოსავლიანობა შემცირდება.ელექტრული ჰომოგენიზაცია უკეთესად მუშაობს, ვიდრე ჰომოგენიზაციის სხვა მეთოდებთან შედარებით, მაგრამ შესაძლოა საჭირო გახდეს სხვა მეთოდებთან შერწყმა, როგორიცაა თხევადი აზოტის დაფქვა, ფერმენტული მონელება (ლიზოზიმი/ლიტიკაზა)
2: მოპოვების მეთოდის ოპტიმიზაცია.ფენოლზე დაფუძნებული მეთოდების ყველაზე დიდი პრობლემაა არასრული სტრატიფიკაცია და რნმ-ის ნაწილობრივი დაკარგვა (ზენატანის მთლიანად ამოღება შეუძლებელია).არასრული სტრატიფიკაცია გამოწვეულია ნუკლეინის მჟავისა და ცილის მაღალი შემცველობით, რაც შეიძლება მოგვარდეს გამოყენებული ლიზატის რაოდენობის გაზრდით ან ნიმუშის რაოდენობის შემცირებით.ქლოროფორმის მოპოვების ეტაპი დაემატა ცხიმოვან ქსოვილს.რნმ-ის დანაკარგი შეიძლება შემცირდეს უკანა ამოტუმბვით ან ორგანული ფენის მოცილებით, რასაც მოჰყვება ცენტრიფუგა.სვეტის ცენტრიფუგირებაზე დაფუძნებული მეთოდების ყველაზე დიდი პრობლემა არის ჭარბი ნიმუში.
კლასიკური მოპოვების რჩევები
1. ფენოლის გაწმენდა: დაამატეთ თანაბარი მოცულობა 1:1 ფენოლი/ქლოროფორმი და აურიეთ ენერგიულად 1-2 წუთის განმავლობაში.ცენტრიფუგა მაღალი სიჩქარით 2 წუთის განმავლობაში.ფრთხილად ამოიღეთ სუპერნატანტი (80-90%).არასოდეს მიხვიდეთ შუა ფენამდე.თანაბარი მოცულობის რეაქციის ხსნარი შეიძლება დაემატოს ფენოლს/ქლოროფორმს და ამოიღონ ზენატანი.ორი ზენატანი შეიძლება შერეული იყოს ნუკლეინის მჟავას ნალექისთვის მოსავლიანობის გასაუმჯობესებლად.ნუ იქნებით ზედმეტად ნაზი შერევისას და ნუ ეცდებით მთელი ზენატანის ამოღებას.
2. 70-80% ეთანოლით რეცხვა: რეცხვისას ნუკლეინის მჟავა უნდა შეჩერდეს, რათა უზრუნველყოფილი იყოს ნარჩენი მარილის ჩამორეცხვა.ამავდროულად, ეთანოლის ჩამოსხმისთანავე გააკეთეთ ცენტრიფუგა მაღალი სიჩქარით რამდენიმე წამის განმავლობაში და შემდეგ ამოიღეთ ნარჩენი ეთანოლი პიპეტით.იხსნება ოთახის ტემპერატურაზე 5-10 წუთის განმავლობაში დგომის შემდეგ.
11. სპეციალური ორგანიზაციების მოპოვება
1. ბოჭკოვანი ქსოვილი: რნმ-ის ამოღების გასაღები ბოჭკოვანი ქსოვილიდან, როგორიცაა გული/ჩონჩხის კუნთი, არის ქსოვილის სრული დარღვევა.ამ ქსოვილებს აქვთ დაბალი უჯრედის სიმკვრივე, ამიტომ რნმ-ის რაოდენობა ქსოვილის წონის ერთეულზე დაბალია და უმჯობესია გამოიყენოთ რაც შეიძლება მეტი საწყისი რაოდენობა.აუცილებლად გახეხეთ ქსოვილი გაყინვის პირობებში.
2. ქსოვილები მაღალი ცილის/ცხიმის შემცველობით: ტვინის/მცენარეული ცხიმის შემცველობა მაღალია.PCI ექსტრაქციის შემდეგ, სუპერნატანტი შეიცავს თეთრ ფლოკულებს.სუპერნატანი ხელახლა უნდა გამოიყოს ქლოროფორმით.
3. ქსოვილები მაღალი ნუკლეინის მჟავის/რიბოციმის შემცველობით: ელენთა/თიმუსს აქვს მაღალი ნუკლეინის მჟავა და რიბოციმის შემცველობა.ქსოვილის დაფქვა გაყინვის პირობებში, რასაც მოჰყვება სწრაფი ჰომოგენიზაცია, შეუძლია ეფექტურად გაააქტიუროს რიბოციმები.თუმცა, თუ ლიზატი ძალიან ბლანტია (ნუკლეინის მჟავის მაღალი შემცველობის გამო), PCI ექსტრაქცია ვერ შეძლებს ეფექტურად სტრატიფიკაციას;მეტი ლიზატის დამატებამ შეიძლება მოაგვაროს ეს პრობლემა.მრავალჯერადი PCI ექსტრაქციამ შეიძლება ამოიღოს მეტი ნარჩენი დნმ.თუ თეთრი ნალექი წარმოიქმნება ალკოჰოლის დამატებისთანავე, ეს მიუთითებს დნმ-ის დაბინძურებაზე.მჟავე PCI-ით ხელახალი ექსტრაქცია დაშლის შემდეგ შეუძლია დნმ-ის დაბინძურების მოხსნას.
4. მცენარეული ქსოვილი: მცენარეული ქსოვილი უფრო რთულია, ვიდრე ცხოველური ქსოვილი.ზოგადად, მცენარეები დაფქვავენ თხევადი აზოტის პირობებში, ამიტომ რნმ-ის დეგრადაცია ენდოგენური ფერმენტებით იშვიათია.თუ დეგრადაციის პრობლემა არ მოგვარდება, ეს თითქმის რა თქმა უნდა გამოწვეულია ნიმუშში შემავალი მინარევებით.ბევრ მცენარეში შემავალი მინარევები იწვევს ნარჩენებს, და ნარჩენების მიზეზი ხშირად არის იმის გამო, რომ ამ მინარევებს აქვს გარკვეული მსგავსება რნმ-თან: შენ აგროვებ და მე ნალექი, შენ ადსორბირდები და მე ვიწოვ.ეს მახასიათებლები განსაზღვრავს, რომ ისინი ძალიან ძლიერი ფერმენტის ინჰიბიტორები არიან.
ამჟამად, კომერციული რნმ-ის ექსტრაქციის რეაგენტები შეიძლება ადაპტირდეს თითქმის ყველა ცხოველურ ქსოვილზე მცირე კორექტირებით, მაგრამ არსებობს რამდენიმე კომერციული რნმ-ის ექსტრაქციის რეაგენტები, რომლებიც შეიძლება იყოს შესაფერისი მცენარეთა ქსოვილების უმეტესობისთვის.საბედნიეროდ, Foregene-ს შეუძლია სპეციალურიმცენარეული რნმ-ის ექსტრაქციის ნაკრები, ჩვენ გვაქვსმცენარეთა მთლიანი რნმ-ის იზოლაციის ნაკრები, მცენარეთა მთლიანი რნმ-ის იზოლაციის ნაკრები Plus.ეს უკანასკნელი სპეციალურად შექმნილია პოლისაქარიდებისა და პოლიფენოლის მაღალი შემცველობის მქონე მცენარეებისთვის.რნმ-ის ექსტრაქციისთვის, ლაბორატორიის მომხმარებლების გამოხმაურება განსაკუთრებით კარგია.
12. ნიმუშის გაყინვისა და დნობის ეფექტი გაყინული ნიმუში შეიძლება იყოს უფრო დიდი და საჭიროა მისი მოჭრა რნმ-ის ექსტრაქციისთვის გამოყენებამდე.ნიმუშები დნება (შესაძლოა ნაწილობრივ) ჭრის დროს.გაყინულ ნიმუშებს შესაძლოა დასჭირდეს აწონვა რნმ-ის მოპოვებამდე და ამ პროცესის დროს აუცილებლად მოხდება დათბობა.ზოგჯერ, ნიმუშის დათბობა ასევე ხდება თხევადი აზოტის დაფქვის პროცესში;ან გაყინული ნიმუში პირდაპირ ემატება ლიზატს თხევადი აზოტის დაფქვის გარეშე და დათბობა აუცილებლად მოხდება სრულ ჰომოგენიზაციამდე.ექსპერიმენტებმა აჩვენა, რომ გაყინული ქსოვილი უფრო მიდრეკილია რნმ-ის დეგრადაციისკენ დათბობის დროს, ვიდრე ახალი ქსოვილი.სავარაუდო მიზეზი: გაყინვა-დათბობის პროცესი არღვევს უჯრედის სტრუქტურებს, რაც აადვილებს ენდოგენური ფერმენტების უშუალო კონტაქტს რნმ-თან.
13. რნმ-ის ხარისხის შეფასება ჩვეულებრივ, ელექტროფორეზი გამოიყენება რნმ-ის მთლიანობის შესაფასებლად, ხოლო A260/A280 გამოიყენება რნმ-ის სისუფთავის შესაფასებლად.თეორიულად, ხელუხლებელი რნმ-ს აქვს თანაფარდობა 28S:18S = 2.7:1 და მონაცემების უმეტესობა ხაზს უსვამს 28S:18S = 2:1 თანაფარდობას.ფაქტია, რომ უჯრედების გარდა ნიმუშებიდან ამოღებული თითქმის არცერთი რნმ არ არის 2:1 თანაფარდობით (ეს მიღებული იქნა Agilent Bioanalyzer-ის გამოყენებით).
რნმ-ის ელექტროფორეზის შედეგებზე გავლენას ახდენს მრავალი ფაქტორი, მათ შორის მეორადი სტრუქტურა, ელექტროფორეზის პირობები, ნიმუშის დატვირთვა, EB-ით გაჯერების ხარისხი და ა.შ. გამოიყენეთ ბუნებრივი ელექტროფორეზი რნმ-ის გამოსავლენად და გამოიყენეთ დნმ მარკერი, როგორც კონტროლი.თუ 28S 2 კბ-ზე და 18S 0.9 კბ-ზე ნათელია, და 28S: 18S > 1, მთლიანობა შეიძლება აკმაყოფილებდეს შემდგომი ექსპერიმენტების უმეტესობის მოთხოვნებს.
A260/A280 არის მაჩვენებელი, რომელმაც ბევრი დაბნეულობა გამოიწვია.უპირველეს ყოვლისა, აუცილებელია ამ ინდიკატორის ორიგინალური მნიშვნელობის გარკვევა ნუკლეინის მჟავებისთვის: სუფთა რნმ, მისი A260/280 = დაახლოებით 2.0.სუფთა რნმ არის "მიზეზი" და A260/A280 = 2 არის "ეფექტი".ახლა ყველა იყენებს A260/A280-ს „მიზეზად“ და ფიქრობს, რომ „თუ A260/A280 = 2, მაშინ რნმ სუფთაა“, რაც ბუნებრივია იწვევს დაბნეულობას.
თუ გაინტერესებთ, შეგიძლიათ დაამატოთ მცირე რეაგენტი, რომელიც ხშირად გამოიყენება ექსტრაქციაში, როგორიცაა ფენოლი, გუანიდინის იზოთიოციანატი, PEG და ა.შ., თქვენს რნმ-ს ნიმუშს და შემდეგ გაზომეთ A260/A280 თანაფარდობა.რეალობა ისაა, რომ რნმ-ის ექსტრაქციისთვის გამოყენებული მრავალი რეაგენტი, ისევე როგორც ნიმუშში არსებული მრავალი მინარევები, შთანთქავს დაახლოებით A260 და A280, რაც გავლენას ახდენს A260/A280-ზე.
ყველაზე ინსტრუქციული მიდგომა ამჟამად არის რნმ-ის ნიმუშების სკანირება 200-300 ნმ დიაპაზონში.სუფთა რნმ-ის მრუდს აქვს შემდეგი მახასიათებლები: მრუდი გლუვია, A230 და A260 არის ორი გადახრის წერტილი, A300 ახლოს არის 0-თან, A260/A280 = დაახლოებით 2.0 და A260/A230 = დაახლოებით 2.0.თუ სკანირების მონაცემები არ არის ხელმისაწვდომი, ასევე უნდა განისაზღვროს A260/A230 თანაფარდობა, რადგან ეს თანაფარდობა უფრო მგრძნობიარეა ყველა მინარევების გადატანის მიმართ, რომლებიც გავლენას ახდენენ ფერმენტულ რეაქციაზე.გაითვალისწინეთ მოწყობილობის ხაზოვანი დიაპაზონი (0.1–0.5 A260-ისთვის).
არსებობს კიდევ ორი სასარგებლო ფენომენი: თანაფარდობა იქნება დაახლოებით 0,3-ით დაბალი, როდესაც A260/A280 გაზომილია წყალში;ხოლო 10 მმ EDTA-ში გაზომილი თანაფარდობა დაახლოებით 0.2-ით მეტია ვიდრე 1 მმ EDTA-ში გაზომილი.
Მსგავსი პროდუქტები:
China Plant Total RNA Isolation Kit მწარმოებელი და მიმწოდებელი |Foregene (foreivd.com)
რნმ-ის იზოლაციის სერია – Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)
გამოქვეყნების დრო: ივლის-15-2022
