ცნობილია, რომ ცენტრალურ დოგმაში რნმ არის ტრანსკრიპციული შუამავალი დნმ-სა და ცილის ექსპრესიას შორის.დნმ-ის გამოვლენასთან შედარებით, რნმ-ის აღმოჩენამ შეიძლება უფრო ობიექტურად ასახოს ორგანიზმებში გენის გამოხატულება.რნმ-თან დაკავშირებული ექსპერიმენტები მოიცავს: qRT-PCR, RNA-Seq და შერწყმის გენის აღმოჩენას და ა.შ. თავად რნმ-ის მახასიათებლებზე დაყრდნობით (რნმ-ის შაქრის რგოლს აქვს ერთი თავისუფალი ჰიდროქსილის ჯგუფი, ვიდრე დნმ-ის შაქრის რგოლს), გარემოში RNase-ების დიდ რაოდენობასთან ერთად, რნმ უფრო არასტაბილურია და უფრო ადვილად იშლება, ვიდრე დნმ.ნაგვის შეტანა, ნაგვის გატანა, თუ რნმ-ის ხარისხი არ არის კარგი, მაშინ ექსპერიმენტული შედეგები უნდა იყოს არადამაკმაყოფილებელი, კონკრეტულად გამოვლინდეს არაზუსტი მონაცემებით ან ცუდი განმეორებადობით.ამიტომ მეტი ყურადღება უნდა მიექცეს რნმ-ის დამუშავებას და ხარისხის კონტროლის კავშირი ასევე უფრო მნიშვნელოვანია შემდგომი ექსპერიმენტული მონაცემების სიზუსტისა და სიზუსტის უზრუნველსაყოფად.

რნმ-ის ხარისხის კონტროლისთვის, ზოგადად, არსებობს შემდეგი ხშირად გამოყენებული მეთოდები:

• სპექტროფოტომეტრია
• აგაროზის გელის ელექტროფორეზი
• სწრაფი ბიოანალიზატორი
• რეალურ დროში ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR
• კუბიტის ფლუორესცენტური საღებავის მეთოდი

01 სპექტროფოტომეტრია

რნმ-ს აქვს კონიუგირებული ორმაგი ბმები და აქვს შთანთქმის პიკი ტალღის სიგრძეზე 260 ნმ.ლამბერტ-ბირის კანონის მიხედვით, ჩვენ შეგვიძლია გამოვთვალოთ რნმ-ის კონცენტრაცია შთანთქმის პიკიდან 260 ნმ.გარდა ამისა, ჩვენ ასევე შეგვიძლია გამოვთვალოთ რნმ-ის სისუფთავე 260 ნმ, 280 ნმ და 230 ნმ შთანთქმის პიკების თანაფარდობის მიხედვით.280 ნმ და 230 ნმ არის ცილების და მცირე მოლეკულების შთანთქმის პიკები, შესაბამისად.კვალიფიციური რნმ-ის სისუფთავის A260/A280 და A260/A230 თანაფარდობა უნდა იყოს 2-ზე მეტი. თუ ის 2-ზე ნაკლებია, ეს ნიშნავს, რომ რნმ-ის ნიმუშში არის ცილა ან მცირე მოლეკულური დაბინძურება და ხელახლა უნდა გაწმენდა.დაბინძურების წყაროები გავლენას მოახდენს ქვედა დინების ექსპერიმენტებზე, როგორიცაა PCR რეაქციების გაძლიერების ეფექტურობის დათრგუნვა, რაც გამოიწვევს არაზუსტ რაოდენობრივ შედეგებს.რნმ-ის სისუფთავე დიდ გავლენას ახდენს შემდგომ შედეგებზე, ამიტომ სპექტროფოტომეტრია ზოგადად არის შეუცვლელი ხარისხის კონტროლის რგოლი ნუკლეინის მჟავას ექსპერიმენტების პირველ ეტაპზე.

სურათი 1. ტიპიური რნმ/დნმ შთანთქმის სპექტრი

02 აგაროზის გელის ელექტროფორეზი

გარდა სიწმინდისა, რნმ-ის მთლიანობა ასევე ერთ-ერთი მნიშვნელოვანი მაჩვენებელია რნმ-ის ხარისხის შესაფასებლად.რნმ-ის დეგრადაცია გამოიწვევს ნიმუშში მოკლე ფრაგმენტების დიდ რაოდენობას, ამიტომ შემცირდება რნმ-ის ფრაგმენტების რაოდენობა, რომლებიც შეიძლება ეფექტურად გამოვლინდეს და დაფაროს საცნობარო თანმიმდევრობით.რნმ-ის მთლიანობა შეიძლება შემოწმდეს მთლიანი რნმ-ის ელექტროფორეზით 1% აგაროზის გელზე.ამ მეთოდს შეუძლია თავად მოახდინოს გელის კონფიგურაცია, ან გამოიყენოთ ასაწყობი E-Gel™ სისტემა მთლიანობის შესამოწმებლად.მთლიანი რნმ-ის 80%-ზე მეტი არის რიბოსომური რნმ, რომლის უმრავლესობა შედგება 28S და 18S rRNA-სგან (ძუძუმწოვრების სისტემებში).კარგი ხარისხის რნმ აჩვენებს ორ აშკარა ნათელ ზოლს, რომლებიც არის 28S და 18S კაშკაშა ზოლები, შესაბამისად, 5 Kb და 2 Kb, და თანაფარდობა იქნება 2:1-თან ახლოს.თუ ის დიფუზურ მდგომარეობაშია, ეს ნიშნავს, რომ რნმ-ის ნიმუში შესაძლოა დეგრადირებული იყოს და რეკომენდებულია მოგვიანებით აღწერილი მეთოდის გამოყენება რნმ-ის ხარისხის შემდგომი შესამოწმებლად.

სურათი 2. დეგრადირებული (ხაზი 2) და უცვლელი რნმ (ხაზი 3) შედარება აგაროზის გელის ელექტროფორეზზე

03 Agilent Bioanalyzer

გარდა ზემოთ აღწერილი აგაროზის გელის ელექტროფორეზის მეთოდისა, რომელიც დაგვეხმარება რნმ-ის მთლიანობის მარტივად და სწრაფად ამოცნობაში, ასევე შეგვიძლია გამოვიყენოთ Agilent ბიოანალიზატორი რნმ-ის მთლიანობის დასადგენად.რნმ-ის კონცენტრაციისა და მთლიანობის შესაფასებლად იგი იყენებს მიკროფლუიდების, კაპილარული ელექტროფორეზის და ფლუორესცენციის კომბინაციას.რნმ-ის ნიმუშის პროფილის გასაანალიზებლად ჩაშენებული ალგორითმის გამოყენებით, Agilent ბიოანალიზატორს შეუძლია გამოთვალოს საცნობარო რნმ-ის მთლიანობის მნიშვნელობა, რნმ მთლიანობის ნომერი (შემდგომში RIN) [1].რაც უფრო დიდია RIN-ის მნიშვნელობა, მით უფრო მაღალია რნმ-ის მთლიანობა (1 უკიდურესად დეგრადირებულია, 10 არის ყველაზე სრულყოფილი).ზოგიერთი ექსპერიმენტი, რომელიც მოიცავს რნმ-ს, ვარაუდობს RIN-ის გამოყენებას, როგორც პარამეტრს ხარისხის შეფასებისთვის.მაღალი გამტარუნარიანობის თანმიმდევრობის ექსპერიმენტების (შემდგომში NGS) მაგალითად, Oncomine™ ადამიანის იმუნური რეპერტუარის გაიდლაინები, რომელიც გამოიყენება B უჯრედების და T უჯრედების ანტიგენის რეცეპტორების აღმოსაჩენად Thermo Fisher's Oncomine პანელის სერიაში, ვარაუდობს, რომ ნიმუშები RIN მნიშვნელობებით მეტია, ვიდრე 4, შეიძლება წაიკითხოთ 4-ზე მეტი ეფექტი.არსებობს სხვადასხვა რეკომენდირებული დიაპაზონი სხვადასხვა პანელისთვის და ხშირად უფრო მაღალ RIN-ს შეუძლია უფრო ეფექტური მონაცემების მოტანა.

სურათი 3, Oncomine™ ადამიანის იმუნური რეპერტუარის ექსპერიმენტებში, 4-ზე მეტი RIN-ის მქონე ნიმუშებს შეუძლიათ უფრო ეფექტური წაკითხვისა და T უჯრედების კლონების აღმოჩენა.【2】

თუმცა, RIN მნიშვნელობას ასევე აქვს გარკვეული შეზღუდვები.მიუხედავად იმისა, რომ RIN-ს აქვს მაღალი კორელაცია NGS ექსპერიმენტული მონაცემების ხარისხთან, ის არ არის შესაფერისი FFPE ნიმუშებისთვის.FFPE ნიმუშები ქიმიურად დამუშავებული იყო დიდი ხნის განმავლობაში და ამოღებულ რნმ-ს ზოგადად აქვს შედარებით დაბალი RIN მნიშვნელობა.თუმცა ეს არ ნიშნავს, რომ ექსპერიმენტის ეფექტური მონაცემები არადამაკმაყოფილებელი უნდა იყოს.FFPE ნიმუშების ხარისხის ზუსტად შესაფასებლად, RIN-ის გარდა სხვა გაზომვები უნდა გამოვიყენოთ.RIN-ის გარდა, Agilent ბიოანალიზატორს ასევე შეუძლია გამოთვალოს DV200 მნიშვნელობა, როგორც რნმ-ის ხარისხის შეფასების პარამეტრი.DV200 არის პარამეტრი, რომელიც ითვლის 200 bp-ზე მეტი ფრაგმენტების პროპორციას რნმ-ის ნიმუშში.DV200 არის FFPE ნიმუშის ხარისხის უკეთესი მაჩვენებელი, ვიდრე RIN.FFPE-ს მიერ მოპოვებული რნმ-ისთვის, მას აქვს ძალიან მაღალი კორელაცია იმ გენების რაოდენობასთან, რომელთა ეფექტურად აღმოჩენაც შესაძლებელია და გენების მრავალფეროვნებასთან [3].მიუხედავად იმისა, რომ DV200-ს შეუძლია შეავსოს ხარვეზები FFPE-ის ხარისხის გამოვლენაში, Agilent ბიოანალიზატორი მაინც ვერ ახერხებს რნმ-ის ნიმუშების ხარისხის პრობლემების ყოვლისმომცველ გაანალიზებას, მათ შორის არის თუ არა ნიმუშებში ინჰიბიტორები.თავად ინჰიბიტორებს შეუძლიათ გავლენა მოახდინონ ქვედა დინების ექსპერიმენტების გაძლიერების ეფექტურობაზე და შეამცირონ სასარგებლო მონაცემების რაოდენობა.იმის გასაგებად, არის თუ არა ნიმუშში ინჰიბიტორი, შეგვიძლია მივიღოთ რეალურ დროში ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR მეთოდი, რომელიც აღწერილია შემდეგში.

04 რეალურ დროში ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR

რეალურ დროში ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR მეთოდს შეუძლია არა მხოლოდ აღმოაჩინოს ინჰიბიტორები ნიმუშში, არამედ ზუსტად ასახოს რნმ-ის ხარისხი FFPE ნიმუშში.Agilent ბიოლოგიურ ანალიზატორებთან შედარებით, რეალურ დროში ფლუორესცენციის რაოდენობრივი ინსტრუმენტები უფრო პოპულარულია ძირითად ბიოლოგიურ ლაბორატორიებში მათი ფართო გამოყენების გამო.რნმ-ის ნიმუშების ხარისხის შესამოწმებლად, ჩვენ გვჭირდება მხოლოდ შიდა საცნობარო გენების პრაიმერის ზონდების შეძენა ან მომზადება, როგორიცაა GUSB (Cat no. Hs00939627).პრაიმერების, ზონდების და სტანდარტების ამ ნაკრების გამოყენებით (ცნობილი კონცენტრაციის საერთო რნმ) აბსოლუტური რაოდენობრივი ექსპერიმენტების ჩასატარებლად, რნმ-ის ფრაგმენტის ეფექტური კონცენტრაცია შეიძლება გამოითვალოს რნმ-ის ხარისხის შეფასების სტანდარტად (მოკლედ ფუნქციური რნმ-ის რაოდენობრივი რაოდენობა (FRQ).NGS ტესტში აღმოვაჩინეთ, რომ რნმ-ის ნიმუშების FRQ ძალიან მაღალი კორელაციაა ეფექტურ მონაცემთა მოცულობასთან.ყველა ნიმუშისთვის, რომელიც აღემატება 0.2ng/uL FRQ, წაკითხულთა სულ მცირე 70%-ს შეუძლია ეფექტურად დაფაროს საცნობარო თანმიმდევრობა (სურათი 4).

სურათი 4, ფლუორესცენტური რაოდენობრივი მეთოდით გამოვლენილი FRQ მნიშვნელობა აქვს ძალიან მაღალი კორელაცია (R2>0.9) NGS ექსპერიმენტში მიღებულ ეფექტურ მონაცემებთან.წითელი ხაზი არის FRQ მნიშვნელობა, რომელიც ტოლია 0,2 ნგ/მლ (log10 = -0,7).【4】

გარდა იმისა, რომ გამოიყენება FFPE ნიმუშებზე, რეალურ დროში რაოდენობრივი PCR მეთოდს ასევე შეუძლია ეფექტურად აკონტროლოს ინჰიბიტორები ნიმუშებში.ჩვენ შეგვიძლია დავამატოთ გამოსავლენი ნიმუში რეაქციის სისტემაში შიდა დადებითი კონტროლით (IPC) და მისი ანალიზით, შემდეგ კი ჩავატაროთ ფლუორესცენციის რაოდენობრივი განსაზღვრა Ct მნიშვნელობის მისაღებად.თუ Ct-ის მნიშვნელობა ჩამორჩება Ct-ის მნიშვნელობას უნივერსალური რეაქციაში, ეს მიუთითებს, რომ ინჰიბიტორი იმყოფება ნიმუშში და აფერხებს რეაქციის გაძლიერების ეფექტურობას.

05 კუბიტის ფლუორესცენტური საღებავის მეთოდი

Qubit Fluorometer არის ყველაზე ხშირად გამოყენებული პატარა მოწყობილობა ნუკლეინის მჟავას კონცენტრაციისა და სიწმინდის გამოსავლენად, რომელიც მარტივია და არსებობს მოლეკულური ბიოლოგიის თითქმის ყველა ლაბორატორიაში.ის ზუსტად ითვლის ნუკლეინის მჟავის კონცენტრაციას ნუკლეინის მჟავას დამაკავშირებელი ფლუორესცენტური საღებავის (Qubit-ის გამოვლენის რეაგენტის) გამოვლენით.კუბიტს აქვს მაღალი მგრძნობელობა და სპეციფიკა და შეუძლია ზუსტად განსაზღვროს რნმ pg/μL კონცენტრაციამდე.გარდა ნუკლეინის მჟავას კონცენტრაციის ზუსტი რაოდენობრივი განსაზღვრის ცნობილი უნარისა, Thermo Fisher-ის უახლეს ახალ მოდელს, Qubit 4.0, ასევე შეუძლია აღმოაჩინოს რნმ-ის მთლიანობა.Qubit 4.0-ის რნმ-ის გამოვლენის სისტემა (RNA IQ Assay) ამოიცნობს რნმ-ის მთლიანობას ორი სპეციფიკური ფლუორესცენტური საღებავის ერთდროულად გამოვლენით.ამ ორ ფლუორესცენტულ საღებავს შეუძლია მიბმა რნმ-ის დიდ ფრაგმენტებთან და მცირე ფრაგმენტებთან, შესაბამისად.ეს ორი ფლუორესცენტური საღებავი მიუთითებს ნიმუშში რნმ-ის დიდი ფრაგმენტების პროპორციაზე და აქედან შეიძლება გამოითვალოს IQ (მთლიანობა და ხარისხი), რომელიც წარმოადგენს რნმ-ის ხარისხს.IQ მნიშვნელობა გამოიყენება როგორც FFPE, ასევე არა FFPE ნიმუშებზე და დიდ გავლენას ახდენს შემდგომი თანმიმდევრობის ხარისხზე.მაგალითად, NGS ექსპერიმენტების გათვალისწინებით, Ion torrent™ პლატფორმაზე ჩატარებული RNA-Seq ტესტის ექსპერიმენტებში, ნიმუშების უმეტესობას IQ 4-ზე მეტი მნიშვნელობები ჰქონდა მინიმუმ 50% ეფექტური წაკითხვის შესახებ (სურათი 5).ზემოაღნიშნული გამოვლენის მეთოდებთან შედარებით, Qubit IQ Assay არა მხოლოდ უფრო მოსახერხებელია ფუნქციონირებისთვის და იღებს ნაკლებ დროს (ხუთ წუთში), არამედ აქვს დიდი კორელაცია გაზომილი პარამეტრის IQ მნიშვნელობასა და ქვედა დინების ექსპერიმენტების მონაცემთა ხარისხს შორის.

სურათი 5, არის დიდი კორელაცია Qubit RNA IQ მნიშვნელობასა და RNA-Seq-ის შედგენილ წაკითხვებს შორის.【5】

ზემოაღნიშნული შესავლის საშუალებით, მე მჯერა, რომ ყველას აქვს საკმარისი გაგება რნმ-ის ხარისხის კონტროლის სხვადასხვა მეთოდებზე.პრაქტიკაში, შეგიძლიათ აირჩიოთშესაბამისი მეთოდი ნიმუშის ტიპისა და არსებული ინსტრუმენტების მიხედვით.მხოლოდ რნმ-ის ხარისხის კარგად კონტროლით შეგვიძლია თავიდან ავიცილოთ შემდგომი ექსპერიმენტების წარუმატებლობა, რომელიც გამოწვეულია ნიმუშის ცუდი ხარისხით, რაც დაზოგავს ძვირფას დროს, ენერგიას და ხარჯებს.

საცნობარო პროდუქტები:

ცხოველის მთლიანი რნმ-ის იზოლაციის ნაკრები

უჯრედის მთლიანი რნმ-ის იზოლაციის ნაკრები

ცნობები

【1】 Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.RIN: რნმ-ის მთლიანობის ნომერი რნმ-ის გაზომვებისთვის მთლიანობის მნიშვნელობების მინიჭებისთვის.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Oncomine ადამიანის იმუნური რეპერტუარის მომხმარებლის სახელმძღვანელო (პუბ. No. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, გაძლიერებული ხარისხის მეტრიკა რნმ-ის შესაფასებლად, მიღებული საარქივო ფორმალინში ფიქსირებული პარაფინით ჩაშენებული ქსოვილის ნიმუშებიდან 2, ტოქსიკოლოგიური მეცნიერებები2, ტოქსიკოლოგიური მეცნიერებები17, 57–373,https://doi.org/10.1093/toxsci/