1. რნმ ხსნარის შთანთქმის აღმოჩენა
აბსორბცია 280, 320, 230 და 260 ნმ-ზე წარმოადგენს ნუკლეინის მჟავას, ფონის (ხსნარის სიმღვრივე), მარილის კონცენტრაციას და ორგანულ ნივთიერებებს, როგორიცაა პროტეინი, შესაბამისად.ზოგადად, შეხედეთ მხოლოდ OD260/OD280 (ფარდობა, R).როდესაც 1.8-2.0, ჩვენ ვფიქრობთ, რომ ცილის ან სხვა ორგანული ნივთიერების დაბინძურება რნმ-ში შეიძლება გადაიტანოს, მაგრამ უნდა აღინიშნოს, რომ როდესაც Tris გამოიყენება როგორც ბუფერული შთანთქმის გამოსავლენად, R მნიშვნელობა შეიძლება იყოს 2-ზე მეტი (ზოგადად ეს უნდა იყოს <2.2).როდესაც R<1.8, ხსნარში ცილის ან სხვა ორგანული ნივთიერების დაბინძურება უფრო აშკარაა და რნმ-ის ბედი შეიძლება დადგინდეს საჭიროების მიხედვით.როდესაც R>2.2, ეს ნიშნავს, რომ რნმ ჰიდროლიზებულია ერთ ნუკლეინის მჟავად.
2.რნმ-ის ელექტროფორეზული ნიმუში
ზოგადად, დენატურირებადი გელი გამოიყენება რნმ ელექტროფორეზისთვის, მაგრამ თუ ის მხოლოდ რნმ-ის ხარისხის დასადგენად არის საჭირო, დენატურირებადი გელი არ არის საჭირო და შეიძლება ჩვეულებრივი აგაროზის გელის გამოყენება.ელექტროფორეზის მიზანია გამოავლინოს 28S და 18S ზოლების მთლიანობა და მათი თანაფარდობა, ან mRNA ნაცხის მთლიანობა.ზოგადად, თუ 28S და 18S ზოლები არის ნათელი, მკაფიო და მკვეთრი (იგულისხმება ზოლების კიდეები ნათელია), და 28S-ის სიკაშკაშე ორჯერ მეტია ვიდრე 18S ზოლზე, ჩვენ მიგვაჩნია, რომ რნმ-ის ხარისხი კარგია.
ზემოთ ჩამოთვლილი ორი მეთოდია, რომელსაც ჩვენ ჩვეულებრივ ვიყენებთ, მაგრამ ამ ორი მეთოდიდან არცერთი არ გვეტყვის, არის თუ არა ნარჩენი RNase რნმ ხსნარში.თუ ხსნარში არის ძალიან მცირე რაოდენობით RNase, ძნელია მისი აღმოჩენა ზემოაღნიშნული მეთოდით, მაგრამ შემდგომი ფერმენტული რეაქციების უმეტესობა ტარდება 37 გრადუსზე მაღლა და დიდი ხნის განმავლობაში.ამგვარად, თუ რნმ-ის ხსნარში არის ძალიან მცირე რაოდენობით RNase, მაშინ იქნება ძალიან შესაფერისი გარემო და დრო შემდგომ ექსპერიმენტებში მათი როლის შესასრულებლად და რა თქმა უნდა ექსპერიმენტი ამ დროს ცივი იქნება.ქვემოთ წარმოგიდგენთ მეთოდს, რომელსაც შეუძლია დაადასტუროს არის თუ არა ნარჩენი RNase რნმ ხსნარში.
3. სითბოს შენარჩუნების ტესტი
ნიმუშის კონცენტრაციის მიხედვით, ამოიღეთ ორი 1000 ნგ რნმ რნმ-ის ხსნარიდან და დაამატეთ იგი 0.5 მლ ცენტრიფუგა მილში და შეავსეთ იგი pH 7.0 Tris ბუფერით მთლიანი მოცულობით 10 ul-მდე და შემდეგ დახურეთ მილის თავსახური.განათავსეთ ერთი მათგანი მუდმივი ტემპერატურის წყლის აბაზანაში 70°C-ზე და გააჩერეთ თბილად 1 სთ.მეორე ნაწილი ინახება -20°C მაცივარში 1 სთ.როდესაც დრო ამოიწურება, ამოიღეთ ორი ნიმუში ელექტროფორეზისთვის.ელექტროფორეზის დასრულების შემდეგ, შეადარეთ ორივეს ელექტროფორეზული ზოლები.თუ ორი ზოლები თანმიმდევრულია ან არ აქვთ მნიშვნელოვანი განსხვავება (რა თქმა უნდა, მათი ზოლები ასევე აკმაყოფილებს მე-2 მეთოდის პირობებს), ეს ნიშნავს, რომ რნმ ხსნარში არ არის ნარჩენი RNase დაბინძურება და რნმ-ის ხარისხი ძალიან კარგია.პირიქით, თუ 70°C-ზე ინკუბირებული ნიმუში აჩვენებს აშკარა დეგრადაციას, ეს მიუთითებს, რომ რნმ ხსნარში არის RNase დაბინძურება.
2 რნმ-ის ექსტრაქციის ექსპერიმენტული მეთოდები და ტექნიკა
პრობლემები, რომლებსაც ხშირად ვაწყდებით რნმ-ის მოპოვებისას: (1) რნმ-ის გამოსავლიანობა დაბალია;(2) რნმ-ს აქვს მარილის სერიოზული დაბინძურება;(3) რნმ-ს აქვს სერიოზული ორგანული გამხსნელებით დაბინძურება;(4) ნიმუშის დეგრადაცია და სხვა პრობლემები
1. საერთო რნმ-ის ექსტრაქციის რეაგენტები
გუანიდინის იზოთიოციანატის მეთოდი და ტრიზოლის მეთოდი არის ყველაზე ხშირად გამოყენებული მეთოდები ცხოველთა ქსოვილებიდან და ცხოველური უჯრედებიდან მთლიანი რნმ-ის ამოღების მიზნით.ის განსაკუთრებით შესაფერისია მცირე ზომის ნიმუშებისა და ქსოვილებისთვის, რომელთა ამოღება განსაკუთრებით რთულია, როგორიცაა მთლიანი რნმ-ის ამოღება კურდღლის კანიდან და ცხოველის შემაერთებელი ქსოვილიდან;გარდა ამისა, ტრიზოლი, როგორც ზოგადი დანიშნულების ლიზისის რეაგენტი, ასევე შეიძლება გამოყენებულ იქნას მცენარეული ქსოვილების, ბაქტერიების, სოკოების და სხვა ქსოვილების მოპოვებისთვის.მცენარეული ქსოვილებისთვის, რომლებიც შეიცავს პოლისაქარიდებს და პოლიფენოლებს, როგორიცაა კამელია ოლეიფერა, ჩაის ფოთლები, რაფსის თესლი და ა.შ., CTAB მეთოდი ასევე შეიძლება გამოყენებულ იქნას მთლიანი რნმ-ის მოსაპოვებლად.
როგორც ჩვეულებრივი მეთოდი, ორსვეტიანი მეთოდი ასევე ძალიან პოპულარულია მისი ნორმალური ტემპერატურული მუშაობის გამო, RNase-ის დამატება არ არის საჭირო და უსაფრთხოება - არ არის ქლოროფორმი, ფენოლები და სხვა ორგანული რეაგენტები ექსტრაქციისთვის.(რეკომენდებული პროდუქტები )
2. მთლიანი რნმ-ის ექსტრაქცია ცხოველური ქსოვილებიდან
(1) შეეცადეთ აირჩიოთ ახალი ქსოვილი, თუ ის არ არის ახალი (სასურველია სამი თვის განმავლობაში - მაცივარი 80 ℃ ან გაყინული თხევად აზოტში. ქსოვილის დაჭრისას არ დაჭრათ პირდაპირ ოთახის ტემპერატურაზე, აუცილებლად დადეთ ყინულის კოლოფზე, ეცადეთ თავიდან აიცილოთ განმეორებითი გაყინვა და გალღობა.
(2) გამოიყენეთ სუფთა მაკრატელი და პინცეტი, რომ მოაჭრათ ქსოვილის პატარა ნაჭერი, შეეცადეთ მოაჭრათ ქსოვილის ცენტრალური ნაწილი ნიმუშის მოჭრისას, ან ჯერ გაჭერით ქსოვილის დიდი ნაჭერი შუაზე და შემდეგ გაჭერით ნიმუში ახალი ჭრილობის მდგომარეობაში.ამოღებული ქსოვილი მთლიანად უნდა დაიმსხვრა, გახეხილი ქსოვილი ჩაყარეთ EP ტუბში RNase-ს გარეშე, დაამატეთ ლიზატი, გახეხილი ქსოვილი სრულად უნდა იყოს გამოფენილი ლიზატის მიმართ და მოამზადეთ ჰომოგენიზაციისთვის.
(3) ნორმალური ქსოვილებისთვის, ჰომოგენიზაციისთვის შეარჩიეთ მუხის ზომის ქსოვილები (30-60 მგ).თუ ქსოვილები შეიცავს დიდი რაოდენობით ცილას, ცხიმს ან მკვრივ ბოჭკოვან ქსოვილებს, როგორიცაა ღვიძლი, სათანადოდ გაზარდეთ ან შეამცირეთ მოჭრილი ქსოვილების რაოდენობა (სურვილისამებრ) აირჩიეთ 10-20 მგ).
(4) თუ თევზის კუნთი, კრევეტების ხორცი, მედუზა და წყლის მაღალი შემცველობის სხვა ქსოვილები ამოღებულია, ნიმუშის მოცულობა სათანადოდ უნდა გაიზარდოს (რეკომენდირებულია 100-200 მგ).
(5) თუ პირობები საშუალებას იძლევა, ცხოველური ქსოვილის უშუალოდ ამოღება შესაძლებელია მაღალი გამავლობის ქსოვილის ჰომოგენიზატორით ჰომოგენიზაციის შემდეგ, თუ ასეთი აღჭურვილობა არ არსებობს.
(6) საბოლოო ექსტრაქციის შემდეგ მიღებული რნმ დაუყოვნებლივ უნდა განთავსდეს ყინულის ყუთზე, რათა შემცირდეს რნმ-ის დეგრადაცია.
3. ცხოველური უჯრედის რნმ-ის ექსტრაქცია
(1) სუსპენზიის უჯრედები: პირდაპირ ცენტრიფუგა და გადააგდეთ გარემო, ჩამოიბანეთ სტერილური PBS 1-2-ჯერ, შემდეგ შეაჩერეთ PBS-ის შესაბამისი რაოდენობით და შემდეგ დაამატეთ ლიზატი ლიზისისთვის.არ დაამატოთ ლიზატი პირდაპირ ნალექის უჯრედებში სითხის მთლიანად გადაყრის შემდეგ.ეს გამოიწვევს ჰისტონის შეფუთვას, რომელიც გამოიყოფა გარე შრეზე გაჟღენთილი უჯრედების შეკვრას დალექილი უჯრედების გარე მხარეს, რითაც შეზღუდავს პელეტის შიგნით არსებული უჯრედების კონტაქტს ლიზატთან., რის შედეგადაც ხდება უჯრედების არასრული ლიზისი და რნმ-ის გამომუშავების შემცირება.
(2) უჯრედები, რომლებიც ნახევრად ადჰეზირდება ან არ არის მჭიდროდ მიბმული: საშუალების გადაყრის შემდეგ, გარეცხეთ PBS-ით 1-2-ჯერ, შემდეგ პირდაპირ შეიწოვება PBS-ის შესაბამისი რაოდენობა და ააფეთქეთ კულტურის კერძი პიპეტით ან იარაღით, რათა ააფეთქოთ უჯრედები და გადაიტანეთ ისინი რნმ-ისგან თავისუფალ უჯრედებში.დაამატეთ ლიზატი ფერმენტის EP მილაკში ექსტრაქციისთვის.
(3) ადჰერენტული უჯრედები: ჯერ უნდა დაიჯესტოს ტრიპსინთან, შემდეგ შეგროვდეს RNase-ისგან თავისუფალ EP მილებში, ცენტრიფუგირდეს სუპერნატანტის მოსაშორებლად, 1-2-ჯერ გაირეცხოს PBS-ით ჭარბი ტრიპსინის მოსაშორებლად და ხელახლა შეაჩეროს შესაბამისი რაოდენობით PBS, შემდეგ გადადით ექსტრაქციის საფეხურზე.
4. მცენარეთა რნმ-ის ექსტრაქცია
მცენარეული ქსოვილები მდიდარია ფენოლური ნაერთებით, ან მდიდარია პოლისაქარიდებით, ან შეიცავს ზოგიერთ დაუდგენელ მეორად მეტაბოლიტს, ან აქვს RNase-ს მაღალი აქტივობა.ეს ნივთიერებები მჭიდროდ არის შერწყმული რნმ-თან უჯრედის ლიზისის შემდეგ, რათა წარმოქმნან უხსნადი კომპლექსები ან კოლოიდური ნალექები, რომელთა ამოღება რთულია.ამიტომ, მცენარეული ქსოვილის ამოღებისას, მცენარეებისთვის ნაკრები უნდა შევარჩიოთ.კომპლექტში შემავალ ლიზატს შეუძლია ეფექტურად გადაჭრას პოლიფენოლების მარტივი დაჟანგვის და პოლისაქარიდის ნაერთებისა და ნუკლეინის მჟავების გამოყოფის პრობლემები.
(პოლისაქარიდული პოლიფენოლის მცენარის რნმ-ის ექსტრაქციისთვის რეკომენდებული პროდუქტები:
(1) მცენარის კანი, რბილობი, თესლი, ფოთლები და ა.შ. სრულად უნდა იყოს დაფქული ნაღმტყორცნებით.დაფქვის პროცესში თხევადი აზოტი დროულად უნდა შეივსოს, რათა თავიდან იქნას აცილებული ნიმუშის დნობა.დაფქული ნიმუში სწრაფად უნდა დაემატოს ლიზატს და შეირყა რნმ-ის დეგრადაციის თავიდან ასაცილებლად.
(2) ბოჭკოებით მდიდარი ნიმუშებისთვის, როგორიცაა ბრინჯი და ხორბლის ფოთლები, ექსტრაქციის რაოდენობა უნდა შემცირდეს სათანადოდ, წინააღმდეგ შემთხვევაში ქსოვილის დაფქვა და ლიზისი არ იქნება დასრულებული, რაც გამოიწვევს მოპოვებული რნმ-ის დაბალ მოსავალს.
(3) წყლის მაღალი შემცველობის მქონე მცენარეული ქსოვილებისთვის, როგორიცაა ბროწეულის ნაყოფი, საზამთროს ნაყოფი, ატმის ნაყოფი და ა.შ., ნიმუშის ზომა სათანადოდ უნდა გაიზარდოს (100-200 მგ არჩევითია).
(4) მცენარეული ქსოვილები, როგორიცაა მცენარის ფოთლები, რიზომები, მძიმე ხილი და სხვა მასალები, ზოგადად რეკომენდებულია თხევადი აზოტის გამოყენება ნაღმტყორცნებში ინგრედიენტების საფუძვლიანად დასალევად, შემდეგ კი ექსტრაქციის საფეხურზე გადასვლა.ჩვეულებრივი ქსოვილის ჰომოგენიზატორები შეიძლება არ იყოს ეფექტური მცენარეული ქსოვილების ჰომოგენიზაციაში და, როგორც წესი, არ არის რეკომენდებული.
5. სიფრთხილის ზომები რნმ-ის ექსტრაქციისთვის
(1) ქსოვილის ნიმუშები უნდა იყოს რაც შეიძლება ახალი, რათა თავიდან იქნას აცილებული განმეორებითი გაყინვა და გალღობა.
(2) ამოღების დროს ქსოვილი მთლიანად უნდა იყოს დაფქული, ხოლო ქსოვილის რაოდენობა არ უნდა იყოს ძალიან ცოტა, რომ აღარაფერი ვთქვათ ძალიან ბევრი.
(3) საკმარისი ინკუბაციის დრო უნდა იყოს მინიჭებული ლიზატის დამატების შემდეგ ნიმუშის სრულად დასალიზატორად.
(4) ექსტრაქციისთვის ტრიზოლის მეთოდის გამოყენებისას, სტრატიფიკაციის შემდეგ ზენატანის შთანთქმის პრინციპი არის „მირჩევნია ნაკლები ჩასუნთქვა, ვიდრე მეტი ჩასუნთქვა“, და არ უნდა ამოიღოთ შუა ფენამდე, წინააღმდეგ შემთხვევაში ეს გამოიწვევს გენომიურ დნმ-ის სერიოზულ დაბინძურებას.
(5) რეცხვისას, სარეცხი სითხე სრულად უნდა შეაღწიოს მილის კედლის გარშემო, რათა უზრუნველყოფილი იყოს საფუძვლიანი რეცხვა.
(6) სვეტის ამოღების მეთოდისთვის, გარეცხვის შემდეგ სვეტის გამოყოფის გარდა, ადსორბციული სვეტი ასევე უნდა მოთავსდეს ულტრა სუფთა სკამზე და ააფეთქოს 5-10 წუთის განმავლობაში, რათა ორგანული გამხსნელი სრულად აორთქლდეს სიმშრალემდე.
(7) სვეტის მეთოდის ბოლო გამორეცხვისას, DEPC წყლის დამატების შემდეგ, უნდა მოხდეს მისი ინკუბაცია 3-5 წუთის განმავლობაში, ან DEPC წყალი წინასწარ უნდა გაცხელდეს 60°C-მდე, რათა გაიზარდოს ელუციის გამოსავლიანობა.ტრიზოლის გაყოფისა და იზოპროპანოლის დალექვის ტრადიციულ მეთოდში, საბოლოო რნმ იხსნება DEPC წყალში, ამიტომ შესაბამისი დრო უნდა მიეცეს დაშლას და ცენტრიფუგის მილის ფსკერი მუდმივად უნდა აფეთქდეს პიპეტის წვერით.
3 ტhree მიზეზები და გადაწყვეტილებები რნმ-ის დაბალი კონცენტრაციისთვის/ცუდი ხარისხისთვის
1. მოსავლიანობა ძალიან დაბალია
ამოღებული ნიმუში ძალიან დაბალია, მთლიანი რაოდენობა არასაკმარისია, ან ამოღებული ნიმუში ძალიან ბევრია და ლიზისი არ არის დასრულებული;შესაბამისი ხარისხის ქსოვილი ან უჯრედები უნდა იქნას გამოყენებული ექსტრაქციისთვის, ნიმუშის წინასწარი დამუშავება კარგად უნდა მოხდეს და ლიზისი საკმარისი იყოს.
2. გენომის ნარჩენები
ტრიზოლის მეთოდით მოპოვებისას, როდესაც ზენატანი შეიწოვება შუა ფენაში შრეების შემდეგ, წარმოიქმნება გენომის სერიოზული დაბინძურება;განსაკუთრებული სიფრთხილეა საჭირო ფენების დაფენისას, რათა თავიდან აიცილოთ შუა ფენაში შეწოვა.თუ სვეტის მეთოდი გამოიყენება ექსტრაქციისთვის, ამოსაღებად შეიძლება შეირჩეს DNase I შემცველი ნაკრები.მემბრანაზე ადსორბირებული ნუკლეინის მჟავა უშუალოდ შეიწოვება DNase I-ით, რომელსაც შეუძლია მნიშვნელოვნად შეამციროს დნმ-ის ნარჩენები.
3. რნმ-ის დეგრადაცია
ეს შეიძლება იყოს თავად მოპოვებული ნიმუშის დეგრადაცია, ან მოპოვების პროცესში გამოწვეული დეგრადაცია;შეძლებისდაგვარად, ახალი ნიმუშები უნდა იქნას გამოყენებული რნმ-ის ექსტრაქციისთვის, ხოლო შეგროვებული ნიმუშები დროულად უნდა ინახებოდეს თხევად აზოტში ან -80°C მაცივარში და თავიდან იქნას აცილებული განმეორებითი გაყინვა და გალღობა.რნმ-ის ექსტრაქციის პროცესში გამოყენებული უნდა იყოს RNase/DNase თავისუფალი წვერები, ცენტრიფუგის მილები და სხვა მასალები.მოპოვების პროცესი უნდა იყოს რაც შეიძლება სწრაფი.ამოღებული რნმ უნდა განთავსდეს ყინულის კოლოფზე და შეინახოს დროში -80-ზე.თუ მოპოვებული რნმ-ის აღმოჩენაა საჭირო გელის ელექტროფორეზით, ელექტროფორეზი უნდა ჩატარდეს ექსტრაქციისთანავე, ხოლო ელექტროფორეზის ბუფერი უნდა შეიცვალოს ახლად მომზადებულით.
4. მარილი და ორგანული გამხსნელების ნარჩენები
ექსტრაქციის რეაგენტები შეიცავს ფენოლს და გუანიდინის მარილებს, ხოლო სარეცხი ხსნარი შეიცავს ეთანოლს.ექსტრაქციის პროცესში, ლიზატი მთლიანად არ შეიწოვება და არ იქნა გადაყრილი, ხოლო სარეცხი ხსნარი არ იყო ბოლომდე გამხმარი.ნარჩენი მარილები და ორგანული გამხსნელები საზიანოა შემდგომი საპირისპირო ტრანსკრიფციისა და PCR-ისთვის.სხვადასხვა ხარისხის დათრგუნვა, ამიტომ ქსოვილის ლიზატი სრულად უნდა მოიხსნას ექსტრაქციის პროცესში და სარეცხი საკმარისი უნდა იყოს ისე, რომ მილის მიმდებარე კედლები დაიბანოს.გარდა ამისა, მილის დაცლა და აფეთქება აუცილებელი ნაბიჯია, რაც კიდევ უფრო შეამცირებს ორგანული ნივთიერებების ნარჩენებს.
დამატებითი ინფორმაციისთვის რნმ-ის ექსტრაქციის შესახებ, გთხოვთ, მიჰყევით ჩვენს ვებგვერდს:
www.foreivd.com დამატებითი ინფორმაციისთვის.
გამოქვეყნების დრო: დეკ-01-2022
