ჩვენ გამოცდილი მწარმოებელი ვიყავით.უმრავლესობის მოგება თავისი ბაზრის გადამწყვეტ სერთიფიკაციებში დიდი ფასდაკლებით ჩინეთის მაღალი მგრძნობელობის ერთსაფეხურიანი ზონდისთვის Rt-Qpcrნაკრები V2, ხარისხი არის ქარხნული ცხოვრება, მომხმარებელთა მოთხოვნაზე ფოკუსირება არის კომპანიის გადარჩენისა და განვითარების წყარო, ჩვენ ვიცავთ პატიოსნებას და კეთილსინდისიერ სამუშაოს, მოუთმენლად ველით თქვენს მოსვლას!
ჩვენ გამოცდილი მწარმოებელი ვიყავით.უმრავლესობის მოპოვება მისი ბაზრის მნიშვნელოვან სერთიფიკატებშიChina Taq დნმ პოლიმერაზა, Qpcr, ჩვენი კომპანია გპირდებათ: გონივრულ ფასებს, მოკლე წარმოების დროს და დამაკმაყოფილებელ გაყიდვების შემდგომ მომსახურებას, ჩვენ ასევე მივესალმებით თქვენ ეწვიეთ ჩვენს ქარხანას ნებისმიერ დროს.გისურვებთ ახლა ერთად გვქონდეს სასიამოვნო და ხანგრძლივი ბიზნესი!!!

აღწერილობები

ეს ნაკრები იყენებს უნიკალურ ლიზის ბუფერულ სისტემას, რომელსაც შეუძლია სწრაფად გაათავისუფლოს რნმ კულტივირებული უჯრედის ნიმუშებიდან RT-qPCR რეაქციებისთვის, რითაც გამორიცხავს რნმ-ის გაწმენდის დროს შრომატევად პროცესს.რნმ-ის შაბლონის მიღება შესაძლებელია მხოლოდ 7 წუთში.ნაკრებით მოწოდებულ 5×Direct RT Mix და 2×Direct qPCR Mix-SYBR რეაგენტებს შეუძლიათ სწრაფად და ეფექტურად მიიღონ რეალურ დროში რაოდენობრივი PCR შედეგები.

5×Direct RT Mix და 2×Direct qPCR Mix-SYBR აქვთ ძლიერი ინჰიბიტორის ტოლერანტობა და ნიმუშების ლიზატი შეიძლება გამოყენებულ იქნას როგორც შაბლონი პირდაპირ RT-qPCR-სთვის.ეს ნაკრები შეიცავს უნიკალურ რნმ-ს მაღალი აფინურობის Foregene საპირისპირო ტრანსკრიპტაზას და Hot D-Taq დნმ პოლიმერაზას, dNTPs, MgCl₂, რეაქციის ბუფერი, PCR ოპტიმიზატორი და სტაბილიზატორი.

სპეციფიკაციები

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

ნაკრების კომპონენტები

მახასიათებლები და უპირატესობები

■ მარტივი და ეფექტური: Cell Direct RT ტექნოლოგიით, რნმ-ის ნიმუშების მიღება შესაძლებელია მხოლოდ 7 წუთში.

■ ნიმუშის მოთხოვნა მცირეა, შესაძლებელია 10 უჯრედის ტესტირება.

■ მაღალი გამტარუნარიანობა: მას შეუძლია სწრაფად აღმოაჩინოს რნმ უჯრედებში, რომლებიც კულტივირებულია 384, 96, 24, 12, 6 ჭაბურღილის ფირფიტებში.

■ დნმ-ის საშლელს შეუძლია სწრაფად ამოიღოს გამოთავისუფლებული გენომები, მნიშვნელოვნად შეამციროს გავლენა შემდგომ ექსპერიმენტულ შედეგებზე.

■ ოპტიმიზებული RT და qPCR სისტემა ხდის ორეტაპიან RT-PCR საპირისპირო ტრანსკრიფციას უფრო ეფექტურს და PCR-ს უფრო სპეციფიკურს და უფრო გამძლეს RT-qPCR რეაქციის ინჰიბიტორების მიმართ.

ნაკრების აპლიკაცია

გამოყენების სფერო: კულტივირებული უჯრედები.

- ნიმუშის ლიზისით გამოთავისუფლებული რნმ: გამოიყენება მხოლოდ ამ ნაკრების RT-qPCR შაბლონზე.

- ნაკრების გამოყენება შესაძლებელია შემდეგი მიზნებისთვის: გენის ექსპრესიის ანალიზი, siRNA-ს შუამავლობით გენის გამაჩუმებელი ეფექტის შემოწმება, წამლების სკრინინგი და ა.შ.

დიაგრამა

შენახვა და შენახვის ვადა

ამ ნაკრების I ნაწილი უნდა ინახებოდეს 4℃ ტემპერატურაზე;II ნაწილი უნდა ინახებოდეს -20℃ ტემპერატურაზე.

Foregene Protease Plus II უნდა ინახებოდეს 4℃ ტემპერატურაზე, არ გაყინოთ -20℃.

რეაგენტი 2×Direct qPCR Mix-SYBR უნდა ინახებოდეს -20℃ სიბნელეში;თუ ხშირად გამოიყენება, ის ასევე შეიძლება ინახებოდეს 4℃ ტემპერატურაზე მოკლევადიანი შენახვისთვის (გამოიყენება 10 დღის განმავლობაში). ჩვენ გამოცდილი მწარმოებელი ვართ.დიდი ფასდაკლებით ჩინეთის მაღალი მგრძნობელობის ერთსაფეხურიანი ზონდის Rt-Qpcr ნაკრები V2, მისი ბაზრის გადამწყვეტი სერთიფიკატების უმრავლესობის მოგება.
დიდი ფასდაკლებაChina Taq დნმ პოლიმერაზა, Qpcr, ჩვენი კომპანია გპირდებათ: გონივრულ ფასებს, მოკლე წარმოების დროს და დამაკმაყოფილებელ გაყიდვების შემდგომ მომსახურებას, ასევე მივესალმებით თქვენ ეწვიეთ ჩვენს ქარხანას ნებისმიერ დროს.გისურვებთ ახლა ერთად გვქონდეს სასიამოვნო და ხანგრძლივი ბიზნესი!!!

QuickEასიTM Cell Direct RT-qPCR Kit -თაყმan

კატ.No.DRT-01021/01022

უჯრედისთვის პირდაპირი RT-qPCR ≤ 1000000 უჯრედის გამოყენებით

პროდუქტის გაცნობა

ეს პროდუქტი იყენებს უნიკალურ ლიზის ბუფერულ სისტემას რნმ-ის სწრაფად გასათავისუფლებლად კულტივირებული უჯრედის ნიმუშებიდან RT-qPCR რეაქციებისთვის, რაც გამორიცხავს რნმ-ს შრომატევადი და შრომატევადი გაწმენდის პროცესს და მხოლოდ 7 წუთს საჭირო რნმ-ის შაბლონის მისაღებად, 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman-ის მიერ მოწოდებული რეალურ დროში და ეფექტური kit-ით.

5× Direct RT Mix-ს და 2× Direct qPCR Mix-Taqman-ს აქვს ინჰიბიტორების ძლიერი ტოლერანტობა და შეუძლია შეასრულოს ეფექტური შებრუნება და სპეციფიკური გაძლიერება შაბლონად გასაზომი ნიმუშის ლიზატის გამოყენებით.რეაგენტი შეიცავს Foregene საპირისპირო ტრანსკრიპტაზას, Hot D-Taq დნმ პოლიმერაზას, dNTPs, MgCl₂, რეაქციის ბუფერი, PCR ოპტიმიზატორი და სტაბილიზატორი, რომელიც შეიძლება გამოყენებულ იქნას ლიზის ბუფერთან ერთად ნიმუშების სწრაფად და მარტივად გამოსავლენად და აქვს მაღალი მგრძნობელობის, სპეციფიკურობისა და სტაბილურობის მახასიათებლები.

Პროდუქტის მახასიათებლები

მარტივი, ეფექტური Cell Direct RT ტექნოლოგია, რომელსაც სულ მცირე 7 წუთი სჭირდება რნმ-ის ნიმუშების მისაღებად.

ნიმუშის მოთხოვნები მცირეა და მინიმუმ 10 კულტივირებული უჯრედი შეიძლება გამოყენებულ იქნას ექსპერიმენტებისთვის.

მაღალი გამტარუნარიანობა კულტივირებული უჯრედების სწრაფი რნმ-ის შეთვისებისთვის, როგორიცაა 384, 96, 24, 12 და 6 ჭაბურღილის ფირფიტები.

დნმ-ის საშლელს შეუძლია სწრაფად ამოიღოს გამოთავისუფლებული გენომები, რაც მნიშვნელოვნად ამცირებს ზემოქმედებას შემდგომ ექსპერიმენტულ შედეგებზე.

ოპტიმიზებული RT და qPCR სისტემები იძლევა ორეტაპიან RT-PCR-ს უფრო ეფექტური საპირისპირო ტრანსკრიფციით, სპეციფიკურობით და RT-qPCR რეაქციის ინჰიბიტორის უფრო ძლიერი ტოლერანტობით.

ნაკრების აპლიკაცია

გამოყენების სფერო: კულტივირებული უჯრედები.

ნიმუშის ლიზისის ინტერპრეტირებული რნმ: გამოიყენება მხოლოდ ორსაფეხურიანი RT-qPCR შაბლონად.

ნაკრები შეიძლება გამოყენებულ იქნას შემდეგი მიზნებისთვის: გენის მარეგულირებელი გამოხატვის ანალიზი, ალელური ტესტირება, წამლების სკრინინგი და ა.შ.

ნაკრების შეზღუდვები

გაძლიერებული ფრაგმენტები ≤ 300 bp.

ნაკრები გამოიყენება უჯრედების ახლად გაშენებისთვის.

პროდუქტის ხარისხის კონტროლი

FOREGENE-ის ტოტალური ხარისხის მართვის სისტემის მიხედვით, Cell Direct RT-qPCR სერიის კომპლექტების თითოეული პარტია მკაცრად შემოწმდება რამდენჯერმე, რათა უზრუნველყოფილი იყოს კომპლექტების თითოეული ჯგუფის ხარისხის საიმედოობა და სტაბილურობა.

ნაკრების შიგთავსი

*:Cell Lysis, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman შესაძლებელია ცალკე შეძენა, დეტალები მოცემულია დანართში 1 (გვერდი 13).

შენახვის პირობები

1. მიწოდების პირობები

დაბალი ტემპერატურის ყინულის პაკეტის ტრანსპორტირების მთელი პროცესი, რათა უზრუნველყოს ნაკრები <4 °C მდგომარეობაში.

2. შენახვის პირობები

შეინახეთ ნაწილი I 4°C, ხოლო ნაწილი II -20°C ტემპერატურაზე.

Foregene Protease Plus II უნდა ინახებოდეს 4°C ტემპერატურაზე, არა გაყინული -20°C-ზე.

რეაგენტი 2× Direct qPCR Mix-Taqman ინახება -20°C-ზე, ან 4°C-ზე ხანმოკლე გამოყენებისთვის, თუ ხშირად გამოიყენება (10 დღის განმავლობაში).

ნაკრების კომპონენტის ინფორმაცია

ბუფერი CL: უზრუნველყოფს უჯრედების ლიზისის რეაქციებისთვის საჭირო გარემოს.

ბუფერი ST: წყვეტს აქტიურ ნივთიერებას ლიზატში, რათა თავიდან აიცილოს ეფექტები შემდგომ RT-ზე.

დნმ-ის საშლელი: დნმ-ის მოსაშორებელი, გენომის ამოღების ეფექტი შემდგომ ექსპერიმენტებზე.

5× Direct RT Mix: შეიცავს მაღალი რნმ-ის აფინურობის Foregene-ის საპირისპირო ტრანსკრიპტაზას, RNase ინჰიბიტორს, dNTP-ებს, სტაბილიზატორებს, გამაძლიერებლებს, ოპტიმიზატორებს და საპირისპირო ტრანსკრიპციის პრაიმერებს ოპტიმალური განლაგებისთვის (შემთხვევითი პრაიმერი, ოლიგო(dT)₁₈პრაიმერი).

Foregene Protease Plus II: ლიზისის ბუფერის კონტექსტში, უჯრედები ლიზდება ნუკლეინის მჟავების გასათავისუფლებლად.

2× Direct qPCR Mix-Taqman: ეს რეაგენტი შეიცავს ცხელ D-Taq დნმ პოლიმერაზას, dNTPs, MgCl₂, რეაქციის ბუფერი, PCR ოპტიმიზატორი და სტაბილიზატორი.

20× ROX Reference Dye: ჩვეულებრივ გამოიყენება ABI-ს, Stratagene-ის და სხვა კომპანიების რეალურ დროში PCR გამაძლიერებელ ინსტრუმენტებზე, გამოიყენება PCR ტუბსა და მილებს შორის განსხვავების დასარეგულირებლად, რომელიც გამოწვეულია PCR დოზირების შეცდომებით.სხვადასხვა ინსტრუმენტებისთვის საჭირო 20× ROX სარეფერენტო საღებავის კონცენტრაცია განსხვავებულია და მომხმარებელს შეუძლია მისი დამატება ინსტრუმენტის რეკომენდებული კონცენტრაციის მიხედვით.

RNase-ის გარეშე ddH₂O: RNase-ისგან თავისუფალი სტერილიზებული ულტრა სუფთა წყალი ორსაფეხურიანი RT-qPCR რეაქციებისთვის.

Სიფრთხილის ზომები:(აუცილებლად წაიკითხეთ სიფრთხილის ზომები ნაკრების გამოყენებამდე)

ყურადღება მიაქციეთ ექსპერიმენტის მუშაობის მეთოდს, რათა თავიდან იქნას აცილებული ნიმუშებს შორის ჯვარედინი დაბინძურება.

ყურადღება მიაქციეთ ექსპერიმენტული გარემოსა და ჭურჭლის სისუფთავეს, რათა თავიდან აიცილოთ RNase დაბინძურება და რნმ-ის დეგრადაცია.

აიღეთ ახალი ან კარგად შენახული უჯრედის ნიმუშები და არასოდეს გამოიყენოთ განმეორებითი გაყინვა-დათბობის უჯრედების ნიმუშები.

5× Direct qPCR Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman თავიდან უნდა აიცილოს განმეორებითი გაყინვა-დათბობა, წინააღმდეგ შემთხვევაში ეს გავლენას მოახდენს საპირისპირო ტრანსკრიფციასა და PCR ეფექტურობაზე.

მომზადებარაციონიადრეოპერაცია

დარწმუნდით, რომ ყურადღებით წაიკითხეთ ინსტრუქციები ამ ნაკრების გამოყენებამდე.Cell Direct RT-qPCR ნაკრები არის მარტივი, მოსახერხებელი და სწრაფი მუშაობისთვის და ინსტრუქციები იძლევა სრულ ინფორმაციას მთელი ნაკრებისა და მისი სწორად გამოყენების შესახებ.გთხოვთ, გამოყენებამდე მოამზადოთ საჭირო ექსპერიმენტული მასალები და აღჭურვილობა.

ექსპერიმენტული მასალები და აღჭურვილობა

◆ კულტურის უჯრედები.

◆ 1.5 მლ ან 2 მლ, RNase-/DNase-ის გარეშე ცენტრიფუგა ტუბი, RNase-/DNase-ის გარეშე წვერი, 0.2 მლ სტერილური qPCR ტუბი.

◆ qPCR მანქანა, პიპეტი, მაგიდის ცენტრიფუგა (≥13400×ზ) (ექსპერიმენტული საჭიროებიდან გამომდინარე) და ა.შ.

Უსაფრთხოება

◆ ეს პროდუქტი განკუთვნილია მხოლოდ სამეცნიერო კვლევის მიზნებისთვის, გთხოვთ, არ გამოიყენოთ იგი ფარმაცევტული, კლინიკური, საკვები და კოსმეტიკური მიზნებისთვის.

◆ ქიმიკატების გამოყენებისას ატარეთ შესაბამისი ლაბორატორიული ტანსაცმელი, ხელთათმანები, დამცავი სათვალეები და ა.შ.

Ოპერაციაგიდები

უჯრედების ლიზისის სისტემები, RT სისტემები და qPCR რეაქციის ხსნარის დანამატის პაკეტები შეიძლება ცალკე შეიძინოთ, დეტალებისთვის დანართში 1 (გვერდი 13).

ოპერაციის სახელმძღვანელო

პასუხი: რნმ-ის გამოშვების ნიმუში

1. უჯრედები წინასწარ დამუშავებული იყო: გარეცხეთ უჯრედის კულტურის ფირფიტა ცივი PBS-ით, შემდეგ დალიეთ უჯრედები (10-10⁶), 10⁶ ვიდრე უჯრედების რაოდენობა, რეკომენდებულია Foregene the Cell and RNA Isolation Kit Total (DE-03111) ან Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) რნმ-ის ექსტრაქციისა და გამწმენდისთვის.

1.1.წებოვანი უჯრედები (მაგალითად, 24 ჭაბურღილის ფირფიტა)

1.1.1.განსაზღვრეთ უჯრედების რაოდენობა თითოეულ ჭაბურღილში, დაადგინეთ, რომ უჯრედების რაოდენობაა 1 × 10⁵და გამოიყენეთ პიპეტი კულტივირების კერძიდან მოსაშორებლად.

1.1.2.თითოეულ ჭას დაამატეთ 200 მკლ წინასწარ გაცივებული 1 × PBS.არ განახორციელოთ პიპეტირება განმეორებით და ამოიღეთ PBS ჭაბურღილებიდან.დახარეთ ფირფიტა და ამოიღეთ რაც შეიძლება მეტი PBS.გააგრძელეთ ნაბიჯი 2.

1.1.3.უჯრედის კულტურის სხვადასხვა კერძი ან საცნობარო ნომრის ცხრილი 1-1 უჯრედის კულტურის ჭურჭელში დაემატა წინასწარ გაცივებული 1 × PBS უჯრედის გასარეცხად.

ცხრილი 1-1: PBS დოზა სხვადასხვა რაოდენობის უჯრედებისთვის

შენიშვნა:უჯრედების მყარად მიმაგრების უზრუნველსაყოფად,უჯრედების დიდი რაოდენობის დაკარგვის თავიდან აცილება რეცხვისას.

1.2.სუსპენზიის უჯრედები ან ადჰერენტული უჯრედები კულტივირებული არაფოროვან ფირფიტებში

1.2.1.ადჰერენტული უჯრედები კულტივირებული არამრავალ ჭაბურღილების ფირფიტებში (სუსპენზიის უჯრედები იწყება შემდეგი საფეხურიდან 1.2.2), აგროვებენ და გამოყოფენ უჯრედებს უჯრედების შეგროვების ნორმალური მეთოდის მიხედვით და ათავსებენ მათ კულტურის ფირფიტაში ან ცენტრიფუგის მილში;თუ გამოიყენება ტრიფსინიზაცია, საჭიროა ცენტრიფუგირება უჯრედების შესაგროვებლად და ნარჩენი ტრიფსინის ამოსაღებად, დამატებული PBS ხელახლა სუსპენდირებული უჯრედები ცალკეულ უჯრედებში უჯრედების დასაშლელად.

1.2.2.უჯრედების რაოდენობის დათვლის შემდეგ, უჯრედები განაწილდა 1×10⁵ ერთი ცენტრიფუგა მილები, შეაგროვეთ უჯრედები ცენტრიფუგირებით 1000 × გ 10 წუთის განმავლობაში.

1.2.3.დაამატეთ 200 μl PBS ცენტრიფუგის მილში, არ გაიკეთოთ პიპეტირება განმეორებით და პირდაპირ ასპირაციით PBS.გადადით მე-2 საფეხურზე. (თუ ძნელია დალექვა და უჯრედები ხელახლა შეჩერდა, შეიძლება შესრულდეს 1000×გ ცენტრიფუგირებული სუპერნატანტის გადაგდებიდან 10 წუთის შემდეგ, უჯრედის მარცვლები გადადით მე-2 საფეხურზე)

2. უჯრედის ლიზისი: ამოიღეთ ბუფერი CL, მისი ტემპერატურა დაბალანსებული ოთახის ტემპერატურამდე, დნმ საშლელი და Foregene Protease Plus II, შემდეგი ცხრილის 1-2 მომზადებული ლიზის სისტემის მიხედვით: (ლიზის ხსნარი მზად არის გამოსაყენებლად).

ცხრილი 1-2: დეკოლტე სისტემის მომზადება (შენიშვნა: ყინულზე მომზადებაში)

3. (მაგალითად, 24 ჭაბურღილის ფირფიტა) პიპეტით ჩაასხით 200 მკლ უჯრედის ლიზისის მასტერ ნაზავი თითოეულ ჭაბურღილში, განმეორებით ააფეთქეთ 5-10 ჯერ, ინკუბაცია ოთახის ტემპერატურაზე (20-25 ℃) 5 წუთის განმავლობაში.

შენიშვნა:ბუშტების წარმოქმნის თავიდან ასაცილებლად, გთხოვთ, პიპეტის პიპეტის მასშტაბის კორექტირება 200 μl ან ნაკლებზე.ლიზისის შემდეგ უჯრედები შეიძლება მოღრუბლული გამოჩნდეს, რაც ნორმალურია.

4.(24 ჭაბურღილის ფირფიტა, როგორც მაგალითად) ემატება სითხეში 20 μl ბუფერი ST (სხვადასხვა ლიზისური სისტემები ბუფერი ST დამატებულია ცხრილში 1-3 ნაჩვენები რაოდენობით), განმეორებითი პიპეტინგი 5-10-ჯერ, ოთახის ტემპერატურაზე (20-25 ℃) ინკუბირებული იყო 2 წუთის განმავლობაში.

შენიშვნა:პიპეტის წვერი განლაგებულია ზედაპირის ქვემოთ, რაც უზრუნველყოფს ლიზატის დამატებას,ბუშტების წარმოქმნის თავიდან ასაცილებლად, გთხოვთ, პიპეტის პიპეტის მასშტაბის კორექტირება 200 μl ან ნაკლებზე.

ცხრილი 1-3:დაამატეთ ბუფერი ST

5.ლიზატი გამოიყენება შემდგომი RT-qPCR ექსპერიმენტებისთვის.თუ შემდგომი ექსპერიმენტები დროულად ვერ ჩატარდება, გთხოვთ, შეინახოთ ყინულზე არა უმეტეს 2 საათის განმავლობაში და შეინახოთ -20℃ ან -80℃ (არაუმეტეს სამი თვისა).

B: RT სისტემის მომზადება

1. ამოიღეთ 5 × Direct RT Mix და მოათავსეთ ყინულის აბაზანაზე, აცადეთ ბუნებრივად გადნება და ნაზად აურიეთ შემდგომი გამოყენებისთვის;ამოიღეთ RNase-ის გარეშე ddH2O და გაადნეთ და მოათავსეთ ყინულის აბაზანაზე შემდგომი გამოყენებისთვის.მოამზადეთ რეაქციის სისტემა ყინულზე ქვემოთ 2-1 ცხრილის მიხედვით.

ცხრილი 2-1: RT რეაქციის სისტემის მომზადება

2. სისტემის ფორმულირების დასრულების შემდეგ, ნაზად შეურიეთ და ცენტრიფუგირდით მოკლედ შემდეგ ცხრილში 2 -2 რეაქციის პირობები RT რეაქცია.

ცხრილი 2-2: RT რეაქციის მდგომარეობის პარამეტრი

3. რეაქციის დასრულების შემდეგ, რეაქციის პროდუქტი მოთავსებულია პირდაპირ ყინულზე qPCR-სთვის, გთხოვთ, მოათავსოთ გრძელვადიანი კონსერვაცია -20℃ ან -80℃.

შენიშვნა: არაგასუფთავებული შაბლონის გამოყენების გამო, თეთრი ნალექები შეიძლება გამოჩნდეს საპირისპირო ტრანსკრიფციის პროდუქტში.ეს ნორმალური მოვლენაა.დაუყონებლივ გააკეთეთ სუპერნატანტის ცენტრიფუგა შემდგომი ექსპერიმენტებისთვის.

შედეგად მიღებული RT რეაქციის ხსნარი ემატება შემდეგი ნაბიჯის რეალურ დროში PCR რეაქციის სისტემებს, რეკომენდებულია რეაქციის სისტემის 10-30%-მდე ოდენობის დამატება.

C: qPCR რეაქციის სისტემის მომზადება

1. B-ს შესაბამისი რაოდენობა მომზადებულია საფეხურზე cDNA შაბლონში შემდეგი ცხრილის 3-1 მიხედვით რეაქციის სისტემის მოსამზადებლად.

შენიშვნა: cDNA შაბლონის რაოდენობა შეადგენს qPCR სისტემის 10-30%-ს.მაგალითად, 20 μl qPCR სისტემაში დაამატეთ 2-6 μl ლიზის ბუფერი, მაგრამ არა უმეტეს 6 μl.

2. ოპტიმიზაციის კარგი qPCR პირობები (ანილირების ტემპერატურა და ა.შ.) qPCR რეაქციისთვის (რეაქციის პირობები მოცემულია ცხრილში 3-2).

შენიშვნა: სცადეთ გამოიყენოთ ოპტიმიზირებული პირობები qPCR რეაქციებისთვის უკეთესი შედეგების მისაღებად.

ცხრილი 3-1: PCR რეაქციის სისტემის მომზადება

1*: პრაიმერის კონცენტრაცია შეიძლება დარეგულირდეს 50-900 ნმ დიაპაზონში, როდესაც პრაიმერის რეაქცია ცუდია.

შენიშვნა: qPCR სისტემა შეიძლება დარეგულირდეს ექსპერიმენტული საჭიროებებისა და ფლუორესცენტული ციკლერის მოდელის მიხედვით.qPCR-სთვის 50-შიμl სისტემა, დაარეგულირეთ რეაგენტის დოზა პროპორციულად 20-ის მიხედვითμl სისტემა.

2*: აირჩიეთ ROX Reference Dye-ის შესაბამისი საბოლოო კონცენტრაცია ფლუორესცენტური რაოდენობრივი თერმოციკლერის მიხედვით.ყველაზე შესაფერისი ROX სარეფერენტო საღებავის კონცენტრაციები ჩვეულებრივი ფლუორესცენტური რაოდენობრივი ციკლერებისთვის ნაჩვენებია ქვემოთ მოცემულ ცხრილში:

ცხრილი 3-2: მოწოდებულია qPCR რეაქციის პირობები

შენიშვნა: საუკეთესო qPCR ეფექტის მისაღებად, გრადიენტული PCR შეიძლება გამოყენებულ იქნას რეაქციის პირობების ოპტიმიზაციისთვის სხვადასხვა შაბლონებისა და სხვადასხვა პრაიმერებისთვის.PCR რეაქციის პირობები განსხვავდება ფლუორესცენციის ანალიზატორის, შაბლონის, პრაიმერის და ა.შ. სპეციფიკურ ოპერაციაში, რეაქციის ოპტიმალური პირობები უნდა იყოს შემუშავებული ფლუორესცენტული რაოდენობრივი თერმული ციკლერის სპეციფიკური პირობების მიხედვით, შაბლონის ტიპი, ინტერესის ფრაგმენტის ზომა, გაძლიერებული ფრაგმენტის ბაზის თანმიმდევრობა და GC შემცველობა და პრაიმერის ხანგრძლივობა, რეაქციის დროის ჩათვლით და ა.შ.

რეალურ დროში PCR პრაიმერის დიზაინის პრინციპები

Forward Primer და Reverse Primer

Real Time PCR-სთვის პრაიმერის დიზაინი ძალიან მნიშვნელოვანია.პრაიმერები დაკავშირებულია PCR გაძლიერების სპეციფიკასთან და ეფექტურობასთან და შეიძლება შეიქმნას შემდეგი პრინციპების მიხედვით:

◆ პრაიმერის სიგრძე: 18-30bp.

◆ GC შემცველობა: 40-60%.

◆ Tm მნიშვნელობა: პრაიმერის დიზაინის პროგრამულ უზრუნველყოფას, როგორიცაა Primer 5, შეუძლია პრაიმერის Tm მნიშვნელობის მიცემა.ზედა და ქვედა დინების პრაიმერების Tm მნიშვნელობები უნდა იყოს რაც შეიძლება ახლოს.ასევე შეიძლება გამოყენებულ იქნას Tm გამოთვლის ფორმულა: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).PCR-ის ჩატარებისას, პრაიმერის Tm მნიშვნელობის 5 °C-ზე დაბალი ტემპერატურა, როგორც წესი, შეირჩევა ანეილირების ტემპერატურად (შედუღების ტემპერატურის შესაბამისმა ზრდამ შეიძლება გაზარდოს PCR რეაქციის სპეციფიკა).

◆ პრაიმერები და PCR პროდუქტები:

◆ დიზაინის პრაიმერის PCR გამაძლიერებელი პროდუქტის სიგრძე სასურველია იყოს 100-150bp.

◆ დიზაინის პრაიმერები შაბლონის მეორად სტრუქტურულ ზონაში მაქსიმალურად უნდა იქნას აცილებული.

◆ მოერიდეთ 2 ან მეტი დამატებითი ფუძის წარმოქმნას ზედა და ქვედა დინების პრაიმერების 3' ბოლოებს შორის.

◆ პრაიმერის 3′ ტერმინალური ბაზა არ შეიძლება იყოს 3 დამატებითი თანმიმდევრული G ან C.

◆ თავად პრაიმერებს არ შეიძლება ჰქონდეთ დამატებითი სტრუქტურები, წინააღმდეგ შემთხვევაში წარმოიქმნება თმის სამაგრი სტრუქტურა, რომელიც გავლენას მოახდენს PCR გაძლიერებაზე.

◆ ATCG უნდა განაწილდეს რაც შეიძლება თანაბრად პრაიმერის თანმიმდევრობით და 3' ტერმინალური ბაზა თავიდან უნდა იქნას აცილებული, როგორც T.

დანართი1:Cell პირდაპირიRT-qPCR ნაკრების კომპონენტიt დანამატის პაკეტი

1.უჯრედის ლიზისის ხსნარი