Escherichia Coli O157: H7 ნუკლეინის მჟავის გამოვლენის ნაკრები (PCR ფლუორესცენტური ზონდის მეთოდი/ლიოფილიზაცია)
ნაკრების აღწერა:
კატა.არა.FP103
იგი გამოიყენება E. coli O157:H7-ის სწრაფი გამოვლენისა და სკრინინგისთვის საკვების, საკვების, წყლის და გარემოს ნიმუშებში.
აღწერილობები
იგი გამოიყენებაE. coli O157:H7-ის სწრაფი გამოვლენა და სკრინინგი საკვების, საკვების, წყლის და გარემოს ნიმუშებში.
[ტესტირების პრინციპი]
ფლუორესცენტური PCR ტექნოლოგიის პრინციპის მიხედვით, სპეციფიკური პრაიმერები და Taqman ზონდები შექმნილია Escherichia coli O157: H7 სპეციფიკური გენისთვის და გამოვლენილია ფლუორესცენტური PCR ინსტრუმენტით, რათა განხორციელდეს Escherichia coli O157: H7 დნმ-ის ხარისხობრივი გამოვლენა.
ნაკრების შიგთავსი
შენიშვნა: ROX არხის ზონდი არ შედის.
| Cკომპონენტები | სპეციფიკაცია | Qერთიანობა |
| ბუფერი ა | მილი | 1 |
| ბუფერი B | მილი | 1 |
| პოზიტიური კონტროლი | მილი | 1 |
| უარყოფითი კონტროლი | მილი | 1 |
მოსალოდნელი გამოყენება
იგი გამოიყენება E. coli O157:H7-ის სწრაფი გამოვლენა და სკრინინგი საკვების, საკვების, წყლის და გარემოს ნიმუშებში.
შენახვის პირობები და ვარგისიანობის ვადა
შეინახეთ -20℃ სიბნელეში და მოერიდეთ განმეორებით გაყინვას და გალღობას.
მოქმედების ვადაა 12თვე, ხოლო წარმოების თარიღი ნაჩვენებია გარე შეფუთვაზე.
ინსტრუმენტები და სახარჯო მასალები
ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR ინსტრუმენტი, პიპეტის იარაღი და შესაბამისი წვერები, მორევის შეკერი, მინი ცენტრიფუგა.
გამოყენება
1. ნიმუშის დამუშავება
1.1 ნიმუშის ტიპი: ეს ნაკრები განკუთვნილია საკვების, საკვების, წყლის ნიმუშებისთვის და სხვა ნიმუშებისთვის, რომლებიც ეჭვმიტანილია Escherichia coli O157:H7-ით დაბინძურებულად.ღრმად დამუშავებული ხორცპროდუქტებისთვის, სასმელებისთვის და პიგმენტების შემცველი სხვა ნივთიერებებისთვის, ისინი უნდა გაირეცხონ, რათა თავიდან აიცილონ გავლენა ფლუორესცენციის სიგნალის შეგროვებაზე.
1.2 ნიმუშის დამუშავება: იხილეთ „GB 4789.10-2016 სურსათის უვნებლობის ეროვნული სტანდარტული კვების მიკრობიოლოგიური გამოკვლევა Escherichia coli O157: H7 ტესტი“ ნიმუშის მომზადებისთვის, გამდიდრების კულტურისთვის და Escherichia coli O157: H7 იზოლირებისთვის.
- Nუკლეინის მჟავის ექსტრაქცია
მიიღეთ 20 მლ გამდიდრების ხსნარი 1,5 მლ ცენტრიფუგის მილში, დაამატეთ 200 μL მიკრობული ლიზატი (საჭიროა დამატებითი ნაკრები), მორევა 30 წამის განმავლობაში, მოკლედ ცენტრიფუგა და განზე.
შენიშვნები: ნუკლეინის მჟავის ამოღება ლიზატიდან უნდა დასრულდეს 10 წუთში და არ შეიძლება დიდხანს შენახვა.
3. ნუკლეინის მჟავის გაძლიერება
3.1 ჩართეთ ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR ინსტრუმენტი გამოსაყენებლად.
ბუფერი A და ბუფერი B კომპლექტიდან, გაადნეთ ისინი კარგად და მოკლედ გააკეთეთ ცენტრიფუგა.დაამატეთ 18 μL ბუფერი A და 2 μL ბუფერი B თითოეულ PCR რეაქციის მილს.შემდეგ დაამატეთ 5 მლ თითოეული უარყოფითი კონტროლი, ამოღებული ნუკლეინის მჟავა და დადებითი კონტროლი PCR რეაქციის მილებში, დაახურეთ მილები და მოკლედ გააკეთეთ ცენტრიფუგა.
3.3 გადაიტანეთ PCR რეაქციის მილი ფლუორესცენტულ PCR აპარატში და გამოიყენეთ შემდეგი პროცედურები ამპლიფიკაციის ექსპერიმენტების ჩასატარებლად: აირჩიეთ 25 მლ რეაქციის სისტემისთვის, შეაგროვეთ ფლუორესცენტური სიგნალები 60°C-ზე თითოეული ციკლისთვის და აირჩიეთ FAM გამოვლენის არხისთვის.
| ნაბიჯი | პროგრამა | ციკლების რაოდენობა |
| 1 | 37℃ 5 წთ | 1 |
| 2 | 9 5 ℃ 3 წთ | 1 |
| 3 | 95°C 15წმ | 4 0 |
| 60℃ 30 წმ (ფლუორესცენციის შეგროვება) |
სახელმძღვანელო პრობლემების ანალიზისთვის
The following is an analysis of the problems that might be encountered in the extraction of viral RNA. We wish it would be helpful to your experiment. In addition, for other experimental or technical problems other than operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. Contact us if you need at : 028-83361257or E-mail：Tech@foregene.com。
არ შეიძლება რნმ-ის ამოღება ან ნუკლეინის მჟავის გამოსავალი დაბალია
როგორც წესი, არსებობს მრავალი ფაქტორი, რომელიც გავლენას ახდენს აღდგენის ეფექტურობაზე, როგორიცაა: ნიმუშის რნმ-ის შემცველობა, მოქმედების მეთოდი, გამორეცხვის მოცულობა და ა.შ.
საერთო მიზეზების ანალიზი:
1.ყინულის აბაზანა ან დაბალი ტემპერატურის (4°C) ცენტრიფუგირება ოპერაციის დროს.
შემოთავაზება: ოთახის ტემპერატურაზე (15-25°C) მუშაობა, არასოდეს ყინულის აბაზანა და დაბალი ტემპერატურის ცენტრიფუგა.
2. ნიმუშის არასწორი შენახვა ან ნიმუშის ძალიან დიდი ხნის განმავლობაში შენახვა.
შემოთავაზება: შეინახეთ ნიმუშები -80 °C ტემპერატურაზე ან გაყინეთ თხევად აზოტში და მოერიდეთ გაყინვა-დათბობის განმეორებით გამოყენებას;შეეცადეთ გამოიყენოთ ახლად შეგროვებული ნიმუშები რნმ-ის ექსტრაქციისთვის.
3.არასაკმარისი ნიმუშის ლიზი
რეკომენდაცია: დარწმუნდით, რომ ნიმუში და სამუშაო ხსნარი (ხაზოვანი აკრილამიდი) საფუძვლიანად არის შერეული და ინკუბირებული 10 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე (15-25 ° C)
4.ელუენტი დამატებულია არასწორად
რეკომენდაცია: დარწმუნდით, რომ RNase-ის გარეშე ddH2O დამატებულია გამწმენდი სვეტის მემბრანის შუაში
5. უწყლო ეთანოლის არასათანადო მოცულობა ბუფერში viRW2
შემოთავაზება: გთხოვთ, მიჰყევით ინსტრუქციას, დაამატეთ უწყლო ეთანოლის სწორი მოცულობა Buffer viRW2-ში და კარგად აურიეთ ნაკრების გამოყენებამდე.
6. ნიმუშის არასათანადო გამოყენება.
შემოთავაზება: 200μl ნიმუში 500μl Buffer viRL-ზე.ნიმუშის გადაჭარბებული მოცულობა გამოიწვევს რნმ-ის ექსტრაქციის სიჩქარის შემცირებას.
7. გამორეცხვის არასათანადო მოცულობა ან არასრული ელუცია.
წინადადება: გამწმენდი სვეტის ელუენტის მოცულობა არის 30-50 μl;თუ გამორეცხვის ეფექტი არ არის დამაკმაყოფილებელი, რეკომენდებულია წინასწარ გახურებული RNase-ის გარეშე ddH დამატება.2O და გაახანგრძლივეთ ოთახის ტემპერატურაზე განთავსების დრო, როგორიცაა 5-10 წუთი
8. გამწმენდ სვეტს აქვს ეთანოლის ნარჩენი ბუფერში viRW2-ში ჩამობანის შემდეგ.
წინადადება: თუ ეთანოლი კვლავ რჩება ბუფერში viRW2-ში გამრეცხვისა და ცარიელ მილში ცენტრიფუგაციის შემდეგ 2 წუთის განმავლობაში, გამწმენდი სვეტი შეიძლება დარჩეს ოთახის ტემპერატურაზე 5 წუთის განმავლობაში ცარიელ მილში ცენტრიფუგაციის შემდეგ დარჩენილი ეთანოლის სრულად მოსაშორებლად.
გასუფთავებული რნმ-ის მოლეკულების დეგრადაცია
გასუფთავებული რნმ-ის ხარისხი დაკავშირებულია ისეთ ფაქტორებთან, როგორიცაა ნიმუშის შენახვა, RNase დაბინძურება და ოპერაცია.
საერთო მიზეზების ანალიზი:
1. შეგროვებული ნიმუშები დროულად არ იყო შენახული.
წინადადება: თუ ნიმუში დროულად არ იქნა გამოყენებული შეგროვების შემდეგ, გთხოვთ, დაუყოვნებლივ შეინახოთ იგი -80 ℃ ტემპერატურაზე ან თხევადი აზოტით.რნმ-ის მოლეკულების ექსტრაქციისთვის შეეცადეთ გამოიყენოთ ახლად შეგროვებული ნიმუშები შეძლებისდაგვარად.
2. შეგროვებული ნიმუშები არაერთხელ იყინებოდა და დნებოდა.
წინადადება: მოერიდეთ განმეორებით გაყინვას და გალღობას (არა უმეტეს ერთხელ) ნიმუშის შეგროვებისა და შენახვის დროს, წინააღმდეგ შემთხვევაში ნუკლეინის მჟავას გამოსავლიანობა შემცირდება.
3.RNase შეყვანილი იყო საოპერაციო ოთახში ან არ ეცვათ ერთჯერადი ხელთათმანები, ნიღბები და ა.შ.
წინადადება: რნმ-ის მოლეკულების ექსპერიმენტის ექსტრაქცია საუკეთესოდ ჩატარდება რნმ-ის საოპერაციო ოთახში და ექსპერიმენტის ცხრილი გაიწმინდება ექსპერიმენტამდე.ატარეთ ერთჯერადი ხელთათმანები და ნიღბები ექსპერიმენტის დროს, რათა თავიდან აიცილოთ რნმ-ის დეგრადაცია, რომელიც გამოწვეულია RNase-ის შეყვანით.
4. გამოყენებისას რეაგენტი დაბინძურებულია RNase-ით.
შემოთავაზება: შეცვალეთ ახალი ვირუსული რნმ-ის საიზოლაციო ნაკრები შესაბამისი ექსპერიმენტებისთვის.
5. ცენტრიფუგის მილების, პიპეტების წვერების და ა.შ. RNase დაბინძურება. შემოთავაზება: დარწმუნდით, რომ ცენტრიფუგის მილები, პიპეტების წვერები და პიპეტები არ შეიცავს RNase-ს.
გაწმენდილი რნმ-ის მოლეკულები გავლენას ახდენდნენ ქვედა დინებაში ექსპერიმენტებზე
გამწმენდი სვეტით გაწმენდილი რნმ-ის მოლეკულები გავლენას მოახდენს ქვედა დინების ექსპერიმენტებზე, თუ მარილის იონები ან ცილა ძალიან ბევრია, როგორიცაა: საპირისპირო ტრანსკრიფცია, Northern Blot და ა.შ.
1. გამორეცხულ რნმ-ის მოლეკულებში რჩება მარილის იონები.
რეკომენდაცია: დარწმუნდით, რომ უწყლო ეთანოლის სწორი მოცულობა დაემატა Buffer viRW2-ს და გარეცხეთ გამწმენდი სვეტი ორჯერ, საოპერაციო ინსტრუქციებში მითითებული ცენტრიფუგაციის სწორი სიჩქარის მიხედვით. თუ მარილის იონები ჯერ კიდევ დარჩა, შეგიძლიათ დაამატოთ Buffer viRW2 გამწმენდ სვეტში და დატოვეთ იგი ოთახის ტემპერატურაზე 5 წუთის განმავლობაში.შემდეგ შეასრულეთ ცენტრიფუგაცია მარილის იონების დაბინძურების მაქსიმალური მოცილების მიზნით
2. გამოყოფილ რნმ-ის მოლეკულებში დარჩენილია ეთანოლი
შემოთავაზება: როგორც კი დაადასტურეთ, რომ გამწმენდი სვეტები გაირეცხა ბუფერული viRW2-ით, ჩაატარეთ ცენტრიფუგაცია ცარიელ მილში, ოპერაციულ ინსტრუქციებში მითითებული ცენტრიდანული სიჩქარის შესაბამისად.თუ ჯერ კიდევ დარჩა ეთანოლი, ის შეიძლება 5 წუთის განმავლობაში დატოვოთ ოთახის ტემპერატურაზე ცარიელ მილში ცენტრიფუგაციის შემდეგ, რათა დარჩენილი ეთანოლი მაქსიმალურად მოიხსნას.
ინსტრუქციის სახელმძღვანელოები:
ვირუსული რნმ-ის იზოლაციის ნაკრების ინსტრუქციის სახელმძღვანელო
