1. საწყისი გაგება

ამ ეტაპზე, ჩვენ უნდა გვესმოდეს რამდენიმე კონცეფცია და ტერმინოლოგია, რათა თავიდან ავიცილოთ შეცდომები ჩვენი უფროსების წინაშე, როგორიცაა:

Q: რა განსხვავებაა RT-PCR, qPCR, რეალურ დროში PCR და რეალურ დროში RT-PCR-ს შორის?

პასუხი: RT-PCR არის საპირისპირო ტრანსკრიფციის PCR(უკუ ტრანსკრიფციის PCR, RT-PCR), რომელიც არის პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის (PCR) ფართოდ გამოყენებული ვარიანტი.RT-PCR-ში რნმ-ის ჯაჭვი უკუ ტრანსკრიბირებულია დამატებით დნმ-ში, რომელიც შემდეგ გამოიყენება დნმ-ის გაძლიერების შაბლონად PCR-ით.
რეალურ დროში-PCR და qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR) იგივეა, ორივე არის რეალურ დროში რაოდენობრივი PCR, რაც ნიშნავს, რომ PCR-ის თითოეულ ციკლს აქვს რეალურ დროში მონაცემთა ჩანაწერები, ასე რომ, საწყისი შაბლონების რაოდენობა შეიძლება დარეგულირდეს ზუსტი ანალიზით.

მიუხედავად იმისა, რომ როგორც Real-time PCR (real-time fluorescent quantitative PCR) და Reverse transcription PCR (reverse transcription PCR) როგორც ჩანს, შემოკლებით არის RT-PCR, საერთაშორისო კონვენცია ასეთია: RT-PCR კონკრეტულად ეხება საპირისპირო ტრანსკრიფციას.PCR, რეალურ დროში PCR ზოგადად შემოკლებით არის qPCR (რაოდენობრივი რეალურ დროში PCR).

და რეალურ დროში RT-PCR (RT-qPCR), ეს არის საპირისპირო ტრანსკრიფცია PCR, რომელიც კომბინირებულია ფლუორესცენტურ რაოდენობრივ ტექნოლოგიასთან.: ჯერ მიიღეთ cDNA (RT) რნმ-ის საპირისპირო ტრანსკრიფციიდან და შემდეგ გამოიყენეთ რეალურ დროში PCR რაოდენობრივი ანალიზისთვის (qPCR).ლაბორატორიების უმეტესობა აკეთებს RT-qPCR, ანუ კვლევას რნმ-ის ექსპრესიის დაქვეითების რეგულირებაზე, ამიტომ qPCR, რომელზეც ყველა საუბრობს ლაბორატორიაში, რეალურად ეხება RT-qPCR, მაგრამ არ უნდა დაგვავიწყდეს, რომ ჯერ კიდევ არსებობს მრავალი დნმ-ის ტესტი კლინიკურ აპლიკაციებში.რაოდენობრივი ანალიზი, როგორიცაა B ჰეპატიტის ვირუსის HBV გამოვლენა.

კითხვა: ბევრი ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR-ის წაკითხვის შემდეგ, რატომ უნდა მოხდეს გაძლიერებული ფრაგმენტის კონტროლი 80-300bp დიაპაზონში?

უპასუხე: თითოეული გენის თანმიმდევრობის სიგრძე განსხვავებულია, ზოგი რამდენიმე კბ, ზოგი ასობით bp, მაგრამ საჭიროა მხოლოდ პროდუქტის სიგრძე იყოს 80-300 bp პრაიმერების დიზაინის დროს, ძალიან მოკლე ან ძალიან გრძელი არ არის შესაფერისი ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR გამოვლენისთვის.პროდუქტის ფრაგმენტი ძალიან მოკლეა იმისათვის, რომ განასხვავოთ პრაიმერი-დიმერი.პრაიმერ-დიმერის სიგრძე არის დაახლოებით 30-40bp და ძნელია გარჩევა, არის თუ არა პრაიმერი-დიმერი თუ პროდუქტი, თუ ის 80bp-ზე ნაკლებია.თუ პროდუქტის ფრაგმენტი ძალიან გრძელია, აღემატება 300bp, ეს ადვილად გამოიწვევს გაძლიერების დაბალ ეფექტურობას და ვერ შეძლებს ეფექტურად აღმოაჩინოს გენის რაოდენობა.

მაგალითად, როდესაც ითვლით რამდენი ადამიანია კლასში, თქვენ მხოლოდ უნდა დაითვალოთ რამდენი პირია.იგივე ეხება გენების აღმოჩენისას, თქვენ მხოლოდ გენის გარკვეული თანმიმდევრობის აღმოჩენა გჭირდებათ, რათა წარმოადგინოთ მთელი თანმიმდევრობა.ადამიანების დათვლა თუ გინდა, უნდა დაითვალო პირიც და ცხვირიც, ყურებიც და სათვალეც, შეცდომის დაშვებაც ადვილია.

გასაფართოებლად, ბიოლოგიურ კვლევაში არის მრავალი კვლევითი შემთხვევა წერტილიდან ზონამდე, რადგან ნებისმიერი სახეობის გენის თანმიმდევრობა ძალიან გრძელია, ყველა ფრაგმენტის გაზომვა არასაჭირო და შეუძლებელია, როგორიცაა ბაქტერიული 16S თანმიმდევრობა.

Q: რა არის ოპტიმალური სიგრძე qPCR პრაიმერის დიზაინისთვის?

უპასუხე: ზოგადად რომ ვთქვათ, პრაიმერის სიგრძე არის დაახლოებით 20-24bp, რაც უკეთესია.რა თქმა უნდა, პრაიმერის დაპროექტებისას ყურადღება უნდა მივაქციოთ პრაიმერის TM მნიშვნელობას, რადგან ეს დაკავშირებულია დამუშავების ოპტიმალურ ტემპერატურასთან.მრავალი ექსპერიმენტის შემდეგ დადასტურდა, რომ 60°C უკეთესი TM მნიშვნელობაა.თუ ანეილირების ტემპერატურა ძალიან დაბალია, ეს ადვილად გამოიწვევს არასპეციფიკურ გაძლიერებას.თუ ანეილირების ტემპერატურა ძალიან მაღალია, გამაძლიერებელი ეფექტურობა იქნება შედარებით დაბალი, გაძლიერების მრუდის პიკი მოგვიანებით დაიწყება და CT მნიშვნელობა შეფერხდება.

კითხვა: რით განსხვავდება საღებავის მეთოდი ზონდის მეთოდისგან?

პასუხი: საღებავის მეთოდიზოგიერთი ფლუორესცენტური საღებავი, როგორიცაა SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO და ა.შ., თავისთავად არ ასხივებს სინათლეს, მაგრამ გამოყოფს ფლუორესცენციას ორჯაჭვიანი დნმ-ის უმნიშვნელო ღართან შეკავშირების შემდეგ.ამიტომ, PCR რეაქციის დასაწყისში, მანქანა ვერ აღმოაჩენს ფლუორესცენტურ სიგნალს.როდესაც რეაქცია მიაღწევს ანეილირება-გაფართოების სტადიას, ორმაგი ჯაჭვი იხსნება და დნმ პოლიმერაზას მოქმედებით სინთეზირდება ახალი ჯაჭვი და ფლუორესცენტური მოლეკულა აკავშირებს dsDNA მცირე ღარს.PCR ციკლების რაოდენობის მატებასთან ერთად, უფრო და უფრო მეტი საღებავი ერწყმის ორჯაჭვიან დნმ-ს და ფლუორესცენტური სიგნალი ასევე მუდმივად უმჯობესდება.საღებავის მეთოდი ძირითადად გამოიყენება სამეცნიერო კვლევებში.
PS: ფრთხილად იყავით ექსპერიმენტის კეთებისას, საღებავი უნდა იყოს შერწყმული ადამიანის დნმ-თან, ფრთხილად გადააქციოთ იგი ფლუორესცენტულ ადამიანად.

საღებავის მეთოდი (მარცხნივ) ზონდის მეთოდი (მარჯვნივ)
PS: ფრთხილად იყავით ექსპერიმენტის კეთებისას, საღებავი უნდა იყოს შერწყმული ადამიანის დნმ-თან, ფრთხილად გადააქციოთ იგი ფლუორესცენტულ ადამიანად.

SYBR მწვანე Ⅰ უკავშირდება დნმ-ის უმნიშვნელო ღარს

გამოკვლევის მეთოდიTaqman ზონდი არის ყველაზე ხშირად გამოყენებული ჰიდროლიზის ზონდი.ზონდის 5′ ბოლოზე არის ფლუორესცენტური ჯგუფი, ჩვეულებრივ FAM, და თავად ზონდი არის სამიზნე გენის კომპლემენტარული თანმიმდევრობა.3′ ბოლოს არის ფლუორესცენტური ჩაქრობის ჯგუფი.ფლუორესცენტული რეზონანსული ენერგიის გადაცემის პრინციპის მიხედვით (Förster-ის რეზონანსული ენერგიის გადაცემა, FRET), როდესაც მომხსენებელი ფლუორესცენტური ჯგუფი (დონორის ფლუორესცენტური მოლეკულა) და ჩამქრალი ფლუორესცენტური ჯგუფი (მიმღები ფლუორესცენტური მოლეკულა) აღგზნებულია, როდესაც სპექტრის გადახურვა ხდება (-71-10-ის სიახლოვე დისტანცია). მიმღები მოლეკულის ფლუორესცენცია, ხოლო ავტოფლუორესცენცია დასუსტებულია.ამიტომ, PCR რეაქციის დასაწყისში, როდესაც ზონდი თავისუფალი და ხელუხლებელია სისტემაში, მომხსენებელი ფლუორესცენტური ჯგუფი არ გამოსცემს ფლუორესცენციას.ანეილირებისას პრაიმერი და ზონდი აკავშირებს შაბლონს.გაფართოების ეტაპზე პოლიმერაზა მუდმივად ასინთეზებს ახალ ჯაჭვებს.დნმ პოლიმერაზას აქვს 5'-3' ეგზონუკლეაზური აქტივობა.ზონდთან მიღწევისას დნმ პოლიმერაზა ჰიდროლიზებს ზონდს შაბლონიდან, გამოყოფს რეპორტიორის ფლუორესცენტულ ჯგუფს ჩამქრალი ფლუორესცენტური ჯგუფისგან და გამოყოფს ფლუორესცენტულ სიგნალს.იმის გამო, რომ ზონდსა და შაბლონს შორის არსებობს ერთი-ერთზე კავშირი, ზონდის მეთოდი ტესტის სიზუსტითა და მგრძნობელობით აღემატება საღებავის მეთოდს.გამოკვლევის მეთოდი ძირითადად გამოიყენება დიაგნოსტიკაში.

კითხვა: რა არის აბსოლუტური რაოდენობები?რა არის ფარდობითი რაოდენობები?

უპასუხე: აბსოლუტური რაოდენობრივი განსაზღვრა გულისხმობს ნიმუშის საწყისი ასლის რაოდენობის გამოთვლას, რომელიც უნდა შემოწმდეს qPCR-ით, მაგალითად, რამდენი HBV ვირუსია 1 მლ სისხლში.ფარდობითი რაოდენობრივად მიღებული შედეგი არის სამიზნე გენის რაოდენობის ცვლილება კონკრეტულ ნიმუშში სხვა საცნობარო ნიმუშთან შედარებით, ხოლო გენის გამოხატულება რეგულირდება ზევით ან ქვევით.

კითხვა: იმოქმედებს თუ არა რნმ-ის ექსტრაქციის რაოდენობა, საპირისპირო ტრანსკრიფციის ეფექტურობა და გაძლიერების ეფექტურობა ექსპერიმენტულ შედეგებზე?
Q: იმოქმედებს თუ არა ნიმუშის შენახვა, ექსტრაქციის რეაგენტები, საპირისპირო ტრანსკრიფციის რეაგენტები და სინათლის გადამცემი სახარჯო მასალები ექსპერიმენტულ შედეგებზე?
კითხვა: რა მეთოდით შეიძლება გამოსწორდეს ექსპერიმენტული მონაცემები?

ამ საკითხებთან დაკავშირებით, ჩვენ მათ დეტალურად აღვწერთ ქვემოთ მოწინავე და გაფართოებულ განყოფილებებში.
2. გაფართოებული ცოდნა

რაც შეეხება რეალურ დროში ფლუორესცენტულ რაოდენობრივ PCR-ს, ჩვენ უნდა ვაღიაროთ რეალობა, რომ ყოველწლიურად ქვეყნდება ათასობით სამეცნიერო კვლევითი ნაშრომი, რომელთა შორის ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR ტექნოლოგია არც თუ ისე მცირეა.

თუ არ არსებობს საერთო სტანდარტი ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR ექსპერიმენტის გასაზომად, შედეგები შეიძლება მნიშვნელოვნად განსხვავდებოდეს.ერთი და იგივე სახეობის ერთი და იგივე გენი, იგივე დამუშავების მეთოდით, გამოვლენის შედეგები ასევე ძალიან განსხვავდება და გვიან მოსულებს გაუჭირდებათ იგივე შედეგების გამეორება.შენ არავინ იცის რომელია სწორი და რომელი არასწორი.

ნიშნავს თუ არა ეს, რომ ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR არის თაღლითური ტექნოლოგია თუ არასანდო ტექნოლოგია?არა, ეს იმიტომ ხდება, რომ ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR უფრო მგრძნობიარე და ზუსტია და ცოტა არასწორი ოპერაცია სრულიად საპირისპირო შედეგებს გამოიღებს.მცირე დანაკარგი არის ათასი მილის დაშორებით.სტატიის ავტორი რეცენზენტებმა შეიძლება არაერთხელ აწამონ.ამავე დროს, ჟურნალის რეცენზენტებსაც უჭირთ არჩევანის გაკეთება სხვადასხვა ექსპერიმენტული შედეგებიდან.

მთლიანობაში, მიუთითებს კონსენსუსის ნაკლებობაზე რეალურ დროში PCR ექსპერიმენტებში.ამ მიზნით, ინდუსტრიის უფროსმა მეცნიერებმა დაიწყეს სტანდარტების ფორმულირება,მოითხოვს კონტრიბუტორებს მიაწოდონ სტატიაში საჭირო ექსპერიმენტული და მონაცემთა დამუშავების დეტალები (მათ შორის აუცილებელი მონაცემები) ამ სტანდარტების შესასრულებლად.

რეცენზენტებს შეუძლიათ განსაჯონ ექსპერიმენტის ხარისხი ამ დეტალების წაკითხვით;მომავალ მკითხველებს ასევე შეუძლიათ გამოიყენონ ეს ექსპერიმენტის გასამეორებლად ან ექსპერიმენტის გასაუმჯობესებლად.მაშინ ამ გზით მიღებული ექსპერიმენტული შედეგები სავსეა ინფორმაციით, ხარისხიანი და გამოსაყენებელი.

MIBBI (მინიმალური ინფორმაცია ბიოლოგიური და ბიოსამედიცინო გამოკვლევებისთვის -http://www.mibbi.org) გაჩნდა.MIBBI არის პროექტი, რომელიც უზრუნველყოფს ექსპერიმენტების სტანდარტებს.გამოქვეყნებულია ბუნებაში.ეს პროექტი მიზნად ისახავს სხვადასხვა ბიოლოგიურ ექსპერიმენტებს, მათ შორის უჯრედის ბიოლოგიას, Microarray, qPCR, რომელზეც ახლა განვიხილავთ და ა.შ. და ითვალისწინებს თითოეული ტიპის ექსპერიმენტს ხელნაწერების წარდგენისას.ეს ინფორმაცია ყოველთვის უნდა იყოს მიწოდებული.

MIBBI პროექტში არის ორი სტატია, რომელიც დაკავშირებულია ფლუორესცენტურ რაოდენობრივ PCR-თან, კერძოდ:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) – სტრუქტურირებული ენა და ანგარიშგების სახელმძღვანელო რეალურ დროში რაოდენობრივი PCR მონაცემებისთვის;
·MIQE (მინიმალური ინფორმაცია რაოდენობრივი რეალურ დროში PCR ექსპერიმენტების გამოქვეყნებისთვის) – მინიმალური ინფორმაცია სტატიების გამოქვეყნებისთვის რეალურ დროში რაოდენობრივი PCR ექსპერიმენტების შესახებ.
პირველ რიგში, მოდით ვისაუბროთ RDML-ზე, ტერმინოლოგიის სპეციფიკაციაზე.

თუ ყველაფრის სტანდარტული განმარტება არ არსებობს, დისკუსიის გაგრძელება შეუძლებელია, რის გამოც გამოცდაზე ტერმინების ახსნა ასე მნიშვნელოვანია.
ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR ექსპერიმენტში გამოყენებული ტერმინოლოგია მოიცავს შემდეგ შინაარსს.QIAGEN-მა ჩვენთვის საუკეთესო შეჯამება გააკეთა.შემდეგი ყველა მშრალიასაქონელი .

გაძლიერების მრუდი
ამპლიფიკაციის მრუდი ეხება PCR პროცესის დროს შექმნილ მრუდს, ციკლის ნომერი, როგორც აბსცისა და რეალურ დროში ფლუორესცენციის ინტენსივობა რეაქციის დროს, როგორც ორდინატი.

შესანიშნავი გამაძლიერებელი მრუდი უნდა ჰქონდეს შემდეგი მახასიათებლები: საბაზისო არის ბრტყელი ან ოდნავ შემცირებული და არ არის აშკარა აღმავალი ტენდენცია;მრუდის დახრის წერტილი ნათელია, ხოლო ექსპონენციალური ფაზის დახრილობა პროპორციულია გამაძლიერებლობის ეფექტურობისა.რაც უფრო დიდია დახრილობა, მით უფრო მაღალია გაძლიერების ეფექტურობა;საერთო გამაძლიერებელი მრუდი პარალელიზმი კარგია, რაც მიუთითებს, რომ თითოეული მილის გამაძლიერებელი ეფექტურობა მსგავსია;აშკარაა დაბალი კონცენტრაციის ნიმუშების ამპლიფიკაციის მრუდის ექსპონენციალური ფაზა.

საბაზისო (საწყისი)
საბაზისო არის ადრეული ციკლის ხმაურის დონე, ჩვეულებრივ იზომება მე-3 და მე-15 ციკლს შორის, რადგან გამაძლიერებელი პროდუქტით გამოწვეული ფლუორესცენციის მნიშვნელობის ზრდა ამ პერიოდის განმავლობაში შეუძლებელია.საბაზისო ხაზის გამოსათვლელად გამოყენებული ციკლების რაოდენობა შეიძლება განსხვავდებოდეს და შეიძლება საჭირო გახდეს მისი შემცირება, თუ გამოიყენება შაბლონის მაღალი რაოდენობა ან თუ სამიზნე გენის გამოხატვის დონე მაღალია.

საბაზისო ხაზის დაყენება მოითხოვს ფლუორესცენციის მონაცემების ნახვას წრფივი გაძლიერების მრუდიდან.საბაზისო ხაზი დაყენებულია ისე, რომ გაძლიერების მრუდის ზრდა იწყება ციკლის რიცხვით, რომელიც აღემატება საბაზისო ციკლის ზედა რიცხვს.საბაზისო ხაზები ინდივიდუალურად უნდა დაინიშნოს თითოეული სამიზნე თანმიმდევრობისთვის.ადრეულ ციკლებში გამოვლენილი საშუალო ფლუორესცენციის მნიშვნელობები უნდა გამოკლდეს გაძლიერებულ პროდუქტებში მიღებულ ფლუორესცენციის მნიშვნელობებს.სხვადასხვა Real-Time PCR პროგრამული უზრუნველყოფის უახლესი ვერსიები იძლევა საბაზისო პარამეტრების ავტომატურ ოპტიმიზაციას ცალკეული ნიმუშებისთვის.

PCR გამაძლიერებელი რეაქციის პირველი რამდენიმე ციკლის განმავლობაში, ფლუორესცენციის სიგნალი დიდად არ იცვლება.სწორ ხაზთან მიახლოებას საბაზისო ხაზს უწოდებენ, მაგრამ თუ ყურადღებით დავაკვირდებით პირველ რამდენიმე ციკლს, დავინახავთ, რომ საბაზისო ხაზის შიგნით არის ის, რაც ხდება ქვემოთ მოცემულ სურათზე.

ფონის ფონი ეხება
არასპეციფიკური ფლუორესცენციის მნიშვნელობა რეაქციაში.მაგალითად: არაეფექტური ფლუორესცენციის ჩაქრობა;ან დიდი რაოდენობით ორჯაჭვიანი დნმ-ის შაბლონები SYBR Green-ის გამოყენების გამო.სიგნალის ფონის კომპონენტები მათემატიკურად ამოღებულია Real-Time PCR პროგრამული ალგორითმის მიერ.

რეპორტიორის სიგნალი
რეპორტიორის სიგნალი ეხება ფლუორესცენტურ სიგნალს, რომელიც გენერირებულია SYBR Green-ით ან ფლუორესცენტურად ეტიკეტირებული თანმიმდევრობის სპეციფიკური ზონდებით რეალურ დროში PCR-ის დროს.

ნორმალიზებული რეპორტიორის სიგნალი (RN)
RN ეხება რეპორტიორის საღებავის ფლუორესცენციის ინტენსივობას გაყოფილი პასიური საცნობარო საღებავის ფლუორესცენციის ინტენსივობაზე, რომელიც იზომება თითოეულ ციკლზე.

პასიური საცნობარო საღებავი
ზოგიერთ რეალურ დროში PCR-ში,ფლუორესცენტური საღებავი ROX გამოიყენება როგორც შიდა მითითება ფლუორესცენტური სიგნალის ნორმალიზებისთვის.იგი ასწორებს ვარიაციებს არაზუსტი პიპეტინგის, ჭაბურღილის პოზიციისა და ფლუორესცენციის რყევების გამო ჭის მიხედვით.

ფლუორესცენციის ბარიერი (ბარიერი)
მორგებული იყო ფონის მნიშვნელობის ზემოთ და მნიშვნელოვნად ქვემოთ გამაძლიერებელი მრუდის პლატოს მნიშვნელობის ქვემოთ.ის უნდა მდებარეობდეს ამპლიფიკაციის მრუდის წრფივ რეგიონში, რომელიც წარმოადგენს PCR გამოვლენის ლოგ-ხაზოვან დიაპაზონს.ზღურბლები უნდა იყოს დაყენებული ლოგ-გაძლიერების მრუდის ხედში ისე, რომ PCR-ის ლოგ-წრფივი ფაზა ადვილად იდენტიფიცირებადი იყოს.თუ რეალურ დროში PCR-ში მრავალი სამიზნე გენი არსებობს, ბარიერი უნდა იყოს მითითებული თითოეული სამიზნისთვის.ზოგადად, PCR რეაქციის პირველი 15 ციკლის ფლუორესცენციის სიგნალი გამოიყენება, როგორც ფლუორესცენციის ფონის სიგნალი, და ფლუორესცენციის ბარიერი 10-ჯერ აღემატება PCR-ის პირველი 3-დან 15 ციკლის ფლუორესცენციის სიგნალის სტანდარტულ გადახრას, ხოლო ფლუორესცენციული ფაზის დაყენება არის PCR-ის ექსპოზიციის ფაზაში.ზოგადად, თითოეულ ინსტრუმენტს აქვს ფლუორესცენციის ბარიერი დაყენებული გამოყენებამდე.

ციკლის ბარიერი (CT) ან გადაკვეთის წერტილი (CP)
ციკლი, რომლის დროსაც გაძლიერების მრუდი კვეთს ზღურბლს (ანუ წერტილი, როდესაც ფლუორესცენციის გამოვლენა მნიშვნელოვნად იზრდება).CT შეიძლება იყოს წილადი და შეიძლება გამოითვალოს საწყისი შაბლონის რაოდენობა.CT მნიშვნელობა წარმოადგენს ციკლების რაოდენობას, როდესაც ფლუორესცენტური სიგნალი თითოეულ PCR რეაქციის მილში აღწევს დადგენილ ზღურბლს.არსებობს წრფივი კავშირი თითოეული შაბლონის CT მნიშვნელობასა და შაბლონის საწყისი ასლის ნომრის ლოგარითმს შორის,რაც უფრო მაღალია საწყისი ასლის ნომერი, მით უფრო მცირეა CT მნიშვნელობა და პირიქით.სტანდარტული მრუდი შეიძლება გაკეთდეს სტანდარტის გამოყენებით ცნობილი საწყისი ასლის ნომრით, სადაც აბსცისა წარმოადგენს CT მნიშვნელობას, ხოლო ორდინატი წარმოადგენს საწყისი ასლის ნომრის ლოგარითმს.ამიტომ, სანამ უცნობი ნიმუშის CT მნიშვნელობა მიიღება, ნიმუშის საწყისი ასლის ნომერი შეიძლება გამოითვალოს სტანდარტული მრუდით.

ΔCT მნიშვნელობა
ΔCT მნიშვნელობა აღწერსგანსხვავება სამიზნე გენსა და შესაბამის ენდოგენური საცნობარო გენის CT მნიშვნელობას შორის, როგორიცაა საყოფაცხოვრებო გენი და გამოიყენება გამოყენებული შაბლონის რაოდენობის ნორმალიზებისთვის:
⇒ΔCT = CT (სამიზნე გენი) – CT (ენდოგენური საცნობარო გენი)

ΔΔCT მნიშვნელობა
ΔΔCT მნიშვნელობა აღწერს განსხვავებას საინტერესო ნიმუშის ΔΔCT მნიშვნელობას (მაგ., სტიმულირებული უჯრედები) და საცნობარო ნიმუშის საშუალო ΔΔCT მნიშვნელობას (მაგ., არასტიმულირებული უჯრედები) შორის.საცნობარო ნიმუშს ასევე უწოდებენ კალიბრაციის ნიმუშს და ყველა სხვა ნიმუში ნორმალიზდება შედარებით რაოდენობრივად:
⇒ΔΔCT = საშუალო ΔCT (საინტერესო ნიმუში) – საშუალო ΔCT (საცნობარო ნიმუში)

ენდოგენური საცნობარო გენები (ენდოგენური საცნობარო გენები)
ენდოგენური საცნობარო გენების გამოხატვის დონეები, როგორიცაა საყოფაცხოვრებო გენები (სახლის მეურნეობის გენები), არ განსხვავდება ნიმუშებს შორის.საცნობარო გენის CT მნიშვნელობების სამიზნე გენთან შედარება საშუალებას იძლევა სამიზნე გენის ექსპრესიის დონის ნორმალიზება შეყვანილი რნმ-ის ან cDNA-ს ოდენობამდე (იხილეთ განყოფილება ΔCT მნიშვნელობების ზემოთ).

შიდა საცნობარო გენები სწორიარნმ-ის შესაძლო დეგრადაცია ან ფერმენტის ინჰიბიტორების არსებობა რნმ-ის ნიმუშებში, აგრეთვე რნმ-ის შემცველობის ცვალებადობა, საპირისპირო ტრანსკრიფციის ეფექტურობა, ნუკლეინის მჟავის აღდგენა და ნიმუშის დამუშავება.ოპტიმალური საცნობარო გენის ასარჩევად, ჩვენ შევცვალეთ ალგორითმი, რათა მის მიერ ექსპერიმენტულ პარამეტრზე დამოკიდებული ოპტიმალური მითითების არჩევა დაუშვას.

Შიდა კონტროლი
საკონტროლო თანმიმდევრობა, რომელიც გაძლიერებულია იმავე რეაქციაში, როგორც სამიზნე თანმიმდევრობა და გამოკვლეულია სხვა ზონდით (ანუ დუპლექს PCR-ის შესრულება).შიდა კონტროლი ხშირად გამოიყენება წარუმატებელი გაძლიერების გამოსარიცხად, მაგალითად, როდესაც სამიზნე თანმიმდევრობა არ არის გამოვლენილი.
კალიბრაციის ნიმუში
საცნობარო ნიმუში (მაგალითად, გაწმენდილი რნმ უჯრედული ხაზიდან ან ქსოვილიდან), რომელიც გამოიყენება ფარდობით რაოდენობრივად ყველა სხვა ნიმუშის შესადარებლად გენის შედარებითი გამოხატვის დონის დასადგენად.კალიბრაციის ნიმუში შეიძლება იყოს ნებისმიერი ნიმუში, მაგრამ ჩვეულებრივ არის საკონტროლო (მაგალითად, დაუმუშავებელი ნიმუში ან ნიმუში ექსპერიმენტის ნულიდან).

დადებითი კონტროლი
გამოიყენეთ საკონტროლო რეაქციებიშაბლონის ცნობილი რაოდენობა.პოზიტიური კონტროლი ხშირად გამოიყენება იმის შესამოწმებლად, რომ პრაიმერის კომპლექტი ან პრაიმერი-ზონდის ნაკრები მუშაობს გამართულად და რომ რეაქცია სწორად არის დაყენებული.

შაბლონის კონტროლის გარეშე (NTC)
საკონტროლო რეაქცია, რომელიც შეიცავს ამპლიფიკაციის რეაქციის ყველა აუცილებელ კომპონენტს, გარდა შაბლონისა, რომელიც ჩვეულებრივ იცვლება წყლით.NTC-ის გამოყენებამ შეიძლება აღმოაჩინოს რეაგენტებით დაბინძურებით ან უცხო დნმ-ით გამოწვეული დაბინძურება, რაც უზრუნველყოფს აღმოჩენის მონაცემების ავთენტურობას და სანდოობას.NTC კონტროლის გაძლიერება მიუთითებს დაბინძურებაზე.

არ არის RT კონტროლი (NRT)
რნმ-ის ექსტრაქციის პროცესი შეიძლება შეიცავდეს ნარჩენ გენომურ დნმ-ს, რომელიც უკიდურესად საზიანოა და არის დამნაშავე, რომელიც გავლენას ახდენს მონაცემთა ხარისხზე და qPCR-ის ბუნებრივ მტერს, ამიტომ ექსპერიმენტების შემუშავებისას ის უნდა იყოს შემუშავებული მხოლოდ რნმ-ის გამოვლენის გასაძლიერებლად.არსებობს ორი გზა, ერთი არის პრაიმერების დაპროექტება ინტრონების გასწვრივ, მეორე არის დნმ-ის მთლიანად ამოღება, რომელია უკეთესი, რაზეც მოგვიანებით იქნება განხილული.NTR კონტროლი არის ჯადოსნური სარკე დნმ-ის დაბინძურების გამოსავლენად.თუ არის გაძლიერება, ეს ნიშნავს, რომ არის დაბინძურება.

სტანდარტები
სტანდარტები არის ცნობილი კონცენტრაციის ან ასლის რიცხვის ნიმუშები, რომლებიც გამოიყენება სტანდარტული მრუდის ასაგებად.სტანდარტის სტაბილურობის უზრუნველსაყოფად, გენის ფრაგმენტი ჩვეულებრივ კლონდება პლაზმიდში და გამოიყენება როგორც სტანდარტი.

სტანდარტული მრუდი
ჩვეულებრივ განზავებულია მინიმუმ 5 კონცენტრაციის გრადიენტად სტანდარტული პროდუქტით გაორმაგების თანაფარდობის მიხედვით და 5 ქულა შედგენილია CT მნიშვნელობისა და ასლის ნომრის კოორდინატებში და წერტილები დაკავშირებულია ხაზის შესაქმნელად სტანდარტული მრუდის შესაქმნელად.თითოეული სტანდარტული მრუდისთვის საჭიროა მისი მოქმედების შემოწმება.დახრილობის მნიშვნელობა ეცემა -3.3-დან -3.8-მდე და თითოეული კონცენტრაცია შესრულებულია სამჯერ.ქულები, რომლებიც მნიშვნელოვნად განსხვავდება სხვა წერტილებისგან, უნდა გაუქმდეს.შესამოწმებელი ნიმუშის CT მნიშვნელობა მოყვანილია სტანდარტულ მრუდში და შეიძლება გამოითვალოს შესამოწმებელი ნიმუშის გამოხატვის დონე.

შესამოწმებელი ნიმუშის CT მნიშვნელობა მოყვანილია სტანდარტულ მრუდში და შეიძლება გამოითვალოს შესამოწმებელი ნიმუშის საწყისი ასლის ნომერი.

ეფექტურობა და დახრილობა
სტანდარტული მრუდის დახრილობა წარმოადგენს რეალურ დროში PCR-ის ეფექტურობას.
· -3,322 დახრილობა მიუთითებს, რომ PCR გამაძლიერებელი ეფექტურობა არის 1, ან 100% ეფექტური და PCR პროდუქტის რაოდენობა ორმაგდება ყოველ ციკლზე.
·–3.322-ზე ნაკლები დახრილობა (მაგ. –3.8) მიუთითებს PCR ეფექტურობაზე
·–3.322–ზე მეტი დახრილობა (მაგ. –3.0) მიუთითებს იმაზე, რომ PCR ეფექტურობა, როგორც ჩანს, 100%-ზე მეტია, რაც საინტერესოა, როგორ შეიძლება PCR-ის ერთი ციკლის წარმოქმნა გაძლიერებული პროდუქტის ორჯერ მეტი?ეს ვითარება ხდება PCR რეაქციის არაწრფივ ფაზაში, ანუ არის დიდი რაოდენობით არასპეციფიკური გაძლიერება.

დნობის მრუდი
qPCR გაძლიერების დასრულების შემდეგ, PCR პროდუქტი თბება.ტემპერატურის მატებასთან ერთად, ორჯაჭვიანი გამაძლიერებელი პროდუქტი თანდათან დნება, რის შედეგადაც მცირდება ფლუორესცენციის ინტენსივობა.როდესაც გარკვეული ტემპერატურა (Tm) მიიღწევა, პროდუქტების დიდი რაოდენობა დნება.ფლუორესცენცია მკვეთრად ეცემა.სხვადასხვა PCR პროდუქტს აქვს სხვადასხვა Tm მნიშვნელობები და განსხვავებული დნობის ტემპერატურა, ასე რომ PCR-ის სპეციფიკის იდენტიფიცირება შესაძლებელია.

დნობის მრუდი (წარმოებული მრუდი)
დნობის მრუდი წარმოიქმნება პიკის რუკის შესაქმნელად, რომელიც უფრო ინტუიციურად ასახავს PCR პროდუქტის ფრაგმენტების მდგომარეობას.ვინაიდან დნობის ტემპერატურა არის დნმ-ის ფრაგმენტის Tm მნიშვნელობა, ზოგიერთი პარამეტრი, რომელიც გავლენას ახდენს დნმ-ის ფრაგმენტის Tm მნიშვნელობაზე, შეიძლება შეფასდეს, როგორიცაა ფრაგმენტის ზომა, GC შემცველობა და ა.შ. ზოგადად, ჩვენი პრაიმერის დიზაინის პრინციპების მიხედვით,გაძლიერებული პროდუქტის სიგრძე 80-300 bp-ის ფარგლებშია, ამიტომ დნობის ტემპერატურა უნდა იყოს 80°C-დან 90°C-მდე.

დნობის მრუდის ინტერპრეტაცია: თუ ერთადერთი ძირითადი პიკი ჩნდება 80°C-90°C შორის, ეს ნიშნავს, რომ ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR არის სრულყოფილი;თუ ძირითადი პიკი ჩნდება 80°C-90°C-ს შორის და სხვადასხვა მწვერვალები გამოჩნდება 80°C-ზე ქვემოთ, ძირითადად განიხილება პრაიმერის დიმერი.თქვენ შეგიძლიათ სცადოთ გაცხელების ტემპერატურის გაზრდა მის მოსაგვარებლად;თუ ძირითადი პიკი ჩნდება 80°C-90°C-ს შორის, ხოლო სხვადასხვა პიკი კვლავ გამოჩნდება ტემპერატურის მატებისას, ძირითადად ითვლება, რომ არსებობს დნმ-ის დაბინძურება და დნმ უნდა მოიხსნას ექსპერიმენტის საწყის ეტაპზე.

რა თქმა უნდა, ჯერ კიდევ არის რამდენიმე არანორმალური სიტუაციები, რომლებიც ქვემოთ სათითაოდ განიხილება.
3. გაფართოებული ცოდნა

qPCR-ის გასაკეთებლად, მე უნდა ვთქვა MIQE,მინიმალური ინფორმაციაგამოქვეყნებისთვისრაოდენობრივირეალურ დროში PCRექსპერიმენტები — მინიმალური ინფორმაცია რეალურ დროში რაოდენობრივი PCR-ის შესახებ სტატიების გამოსაქვეყნებლადექსპერიმენტები.ყველას გაგების გასამარტივებლად, ჩვენ გავამარტივებთ ძირითად შინაარსს.

თქვენ შეგიძლიათ მოძებნოთ MIQE-ს ორიგინალური ტექსტი ინტერნეტში და რაც მთავარია, ის ითვალისწინებსმონაცემთა საკონტროლო სია, რომელიც უნდა იყოს წარმოდგენილი სტატიის გამოქვეყნებისას .

რეცენზენტებს შეუძლიათ განსაჯონ ექსპერიმენტის ხარისხი ამ დეტალების წაკითხვით;მომავალ მკითხველებს ასევე შეუძლიათ გამოიყენონ ეს ექსპერიმენტის გასამეორებლად ან გასაუმჯობესებლად.
აღსანიშნავია, რომ ამ სიაში თითოეული სიის მნიშვნელობა აღინიშნება შესაბამისად E ან D.Რას ნიშნავს?E: არსებითი ინფორმაცია (უნდა იყოს წარმოდგენილი);დ: სასურველი ინფორმაცია (მოაწოდეთ რაც შეიძლება მეტი).

MIQE (1) - ექსპერიმენტული დიზაინი
ბევრმა ნაძირალამ, რომლებმაც დაასრულეს დაცვა მაგისტრატურის დასრულების შემდეგ, არ იციან როგორ გააკეთონ ექსპერიმენტი დამოუკიდებლად, გახსნან რვეულები და გააკეთონ ის, რასაც მასწავლებელი ეუბნება.შედეგად, ექსპერიმენტული დიზაინი არ იყო მკაცრი და ჟურნალის სარედაქციო განყოფილებამ თქვა, რომ მათ სურდათ ამ სურათის და იმ სურათის შედგენა, ასე რომ მათ გააკეთეს ეს გაოგნებული.ასე კეთდება ნაძირლები!

სახლთან უფრო ახლოს, ექსპერიმენტის პირველი პრინციპია განსაზღვრაექსპერიმენტული ლოგიკის სიმკაცრე.ყველაზე ფუნდამენტური რამ არის ექსპერიმენტული დიზაინი და ყველაზე მნიშვნელოვანი ექსპერიმენტული დიზაინის შესახებ არის ის, თუ როგორ უნდა დააყენოთ სამიზნე ნიმუში, საცნობარო ნიმუში (საკონტროლო) და გამეორებების რაოდენობა, რათა ექსპერიმენტული მონაცემები იყოს მითითებული, შესადარებელი და დამაჯერებელი.

სამიზნე ნიმუშიეხება ნიმუშს, რომელიც მოითხოვს ჩვენგან სამიზნე გენის აღმოჩენას გარკვეული მკურნალობის შემდეგ.საცნობარო ნიმუშიარის ნიმუში ყოველგვარი დამუშავების გარეშე, რომელსაც ბიოლოგიაში ხშირად ველურ ტიპად მოიხსენიებენ.

ექსპერიმენტული რეპლიკაძალიან მნიშვნელოვანია.ზოგადად, დამაჯერებელი რეპლიკების რაოდენობა სამზე მეტი უნდა იყოს.აუცილებელია განვასხვავოთ რა არის ბიოლოგიური რეპლიკაცია და რა არის ტექნიკური რეპლიკაცია.

ბიოლოგიური რეპლიკატები: იგივე გადამოწმების ექსპერიმენტი ჩატარდა სხვადასხვა მასალებით (დრო, მცენარეები, პარტიები, რეაქციის ფირფიტები).

ბიოლოგიური დუბლირება
მაგალითისთვის ავიღოთ წიწაკის პესტიციდებით მკურნალობა.გვსურს ABC-ის სამ მცენარეზე შევასხუროთ პესტიციდები, შემდეგ ABC-ის სამი მცენარე სამი ბიოლოგიური რეპლიკაა და ეს არის იგივე გადამოწმების ექსპერიმენტი, რომელიც განხორციელდა სხვადასხვა მასალით.მაგრამ როგორც ექსპერიმენტი, კონტროლი აუცილებლად არის საჭირო, ამიტომ შეგვიძლია A მცენარის ერთ-ერთი ტოტი შევისხუროთ A მცენარის ექსპერიმენტული ჯგუფის შესაქმნელად და არ შევისხუროთ A მცენარის სხვა ტოტები საკონტროლო ჯგუფის შესაქმნელად.იგივე გააკეთე B და C-სთვის.

ტექნიკური რეპლიკა (ტექნიკური რეპლიკა): ეს არის განმეორებითი ექსპერიმენტი, რომელიც შექმნილია ოპერაციით გამოწვეული შეცდომების თავიდან ასაცილებლად, რაც რეალურად არის დუბლიკატი ხვრელი, რომელიც შედის იმავე მასალაში.ორივე მკურნალობას და კონტროლს უნდა ჰქონდეს სამიზნე გენის და შიდა საცნობარო გენის რეპლიკაციური პარამეტრები (მინიმუმ სამი).

ტექნიკური გამეორება
მაგალითისთვის კვლავ აიღეთ პესტიციდებით დამუშავებული წიწაკა.A მცენარის ექსპერიმენტული ჯგუფისთვის ჩვენ გავაკეთეთ სამი PCR ხვრელი 1, 2 და 3 მისი სამიზნე გენის და შიდა საცნობარო გენის შესაბამისად, რათა აეღოთ საშუალო გამოვლენის შემდეგ.მცენარის კონტროლისთვის A ჯგუფები ასევე განიხილება იმავე გზით.ანალოგიურად, გააკეთეთ იგივე მკურნალობა B და C მცენარეებისთვის.ეს არის ტექნიკური გამეორება.

აღსანიშნავია, რომსტატისტიკაში შედის ბიოლოგიური გამეორება, ხოლო ტექნიკური გამეორება არის იმის შესამოწმებლად, არის თუ არა შემთხვევითი მოვლენები ექსპერიმენტულ პროცესში, რათა ექსპერიმენტის შედეგები სანდო გახდეს, ანუ შეცდომების თავიდან აცილება მათი საშუალოს აღებით, როგორც ჩვენ ხშირად ვამბობთ.

უარყოფითი კონტროლი - NTC და NRT
NTC (თარგების გარეშე კონტროლი), კონტროლი შაბლონის გარეშე, გამოიყენება ექსპერიმენტული მასალის დაბინძურების შესამოწმებლად.როგორც წესი, წყალი გამოიყენება შაბლონად.თუ არსებობს ფლუორესცენტური რეაქცია, ეს მიუთითებს, რომ ნუკლეინის მჟავით დაბინძურება მოხდა ლაბორატორიაში.

ეს დაბინძურებები მოდის: უწმინდური წყლისგან, ენდოგენური დნმ-ის შემცველი არაკვალიფიცირებული რეაგენტები, პრაიმერის დაბინძურება, ლაბორატორიული აღჭურვილობის დაბინძურება, აეროზოლური დაბინძურება და ა.შ., საჭიროა RNase scavengers და RNase ინჰიბიტორების გამოყენება.აეროზოლური დაბინძურების აღმოჩენა ყველაზე რთულია.წარმოიდგინეთ, რომ თქვენი ლაბორატორია სმოგს ჰგავს, ჰაერში შეჩერებული სხვადასხვა ნუკლეინის მჟავებით.

NRT (არაუკუ ტრანსკრიპტაზა), კონტროლი საპირისპირო ტრანსკრიფციის გარეშე, არის არაუკუ ტრანსკრიბირებული რნმ, როგორც უარყოფითი კონტროლი, რომელიც წარმოადგენს გდნმ-ის ნარჩენების კონტროლს.

გენის ექსპრესიის შესრულებისას, რნმ-ის რაოდენობა გამოვლინდება საპირისპირო ტრანსკრიპციის შემდეგ cDNA-ს რაოდენობის გამოვლენით.თუ რნმ-ის გაწმენდისას არსებობს gDNA ნარჩენი, ეს გამოიწვევს შეცდომებს ექსპერიმენტულ შედეგებში, რადგან მიღებული რეალური შედეგებია gDNA და cDNA.აგრეგატის დონეზე, არა მხოლოდ cDNA, gDNA მთლიანად უნდა მოიხსნას რნმ-ის ექსტრაქციის დროს.

MIQE (2) - ინფორმაციის ნიმუში
ეგრეთ წოდებული ნიმუშის ინფორმაცია ნიშნავს, რომ როდესაც ჩვენ ვაქვეყნებთ სტატიას qPCR-ის შესახებ, ნათლად უნდა ავხსნათ ნიმუშის ინფორმაცია, რაც სტატიის შეუცვლელი ნაწილია.ანალოგიურად, როდესაც ჩვენ ვამუშავებთ ნიმუშებს, ჩვენ ასევე უნდა დავარეგულიროთ საკუთარი ოპერაციები, რათა უზრუნველვყოთ ნიმუშების ვალიდობა.

ნიმუშის აღწერა მხოლოდ შედეგია და მთელი ექსპერიმენტის განმავლობაში აღებულ მასალებს მეტი ყურადღება უნდა მივაქციოთ.

ექსპერიმენტული მასალების შერჩევა
სისხლის ნიმუშები - აირჩიეთ ახალი სისხლი, არა უმეტეს 4 საათისა.უჯრედის ნიმუშები - აირჩიეთ ახალი უჯრედების შეგროვება ენერგიული ზრდის პერიოდში.ცხოველური ქსოვილი - აირჩიეთ ახალი, ენერგიულად მზარდი ქსოვილი.მცენარეული ქსოვილი - აირჩიეთ ახალი, ახალგაზრდა ქსოვილი.

თქვენ აუცილებლად შენიშნეთ, რომ ამ რამდენიმე წინადადებაში არის საკვანძო სიტყვა: ახალი.
ზემოაღნიშნული ნიმუშებისთვის, ბაზარზე საუკეთესო, ეკონომიური და სტაბილური ნაკრები არის Foregene-ის ნაკრები, რომელსაც შეუძლია სწრაფად და მარტივად ამოიღოს მათი დნმ და რნმ.

სისხლის დნმ-ის მინი ნაკრები

უჯრედის მთლიანი რნმ-ის იზოლაციის ნაკრები

ცხოველის მთლიანი რნმ-ის იზოლაციის ნაკრები

მცენარეთა მთლიანი რნმ-ის იზოლაციის ნაკრები

მცენარეთა ტოტალური რნმ-ის იზოლაციის ნაკრები პლუსი

მცენარეთა დნმ-ის იზოლაციის ნაკრები

ექსპერიმენტული მასალების შენახვა
ზოგადად, ჩვენ არ გირჩევთ ნიმუშების შენახვას, თუ პირობები ამის საშუალებას იძლევა.თუმცა, ბევრი მეგობარია, ვინც სინჯის აღებისთანავე ვერ ატარებს ექსპერიმენტებს და ზოგიერთს სინჯის აღებისთვის მინდორში თხევადი აზოტის ავზების გატანაც კი სჭირდება.

ასეთი შრომისმოყვარე მეგობრისთვის მხოლოდ იმის თქმა შემიძლია, რომ თქვენ არ გესმით რეაგენტის სახარჯო მასალები.ახლა რეაგენტების მოხმარების მრავალი კომპანია აწარმოებს რეაგენტებს, რომლებსაც შეუძლიათ რნმ-ის ნიმუშების შენახვა ოთახის ტემპერატურაზე და თქვენ შეგიძლიათ აირჩიოთ მათი გამოყენება.ჩვეულებრივი შენახვის მეთოდი არის თხევადი აზოტის შენახვა, პატარა თხევადი აზოტის ავზის გამოყენებით, რომელიც ადვილად ტარდება.ნიმუშის ლაბორატორიაში დაბრუნების შემდეგ შეინახეთ -80°C მაცივარში.

რნმ-თან დაკავშირებული ექსპერიმენტებისთვის, ექვსსიტყვიანი პრინციპი უნდა იყოს დაცული:დაბალი ტემპერატურა, ფერმენტების გარეშე,დასწრაფი .

დაბალი ტემპერატურის ცნება ადვილი გასაგებია;ფერმენტების გარეშე, RNase არის ყველგან მსოფლიოში, სადაც ჩვენ ვცხოვრობთ (თორემ თქვენ მოგკლავთ აივ-ით), ასე რომ, როგორ ავიცილოთ თავიდან RNase ექსპერიმენტების დროს, ძალიან მნიშვნელოვანი კონცეფციაა;სწრაფი,მსოფლიოში არ არსებობს კუნგ ფუ, რომლის გატეხვა შეუძლებელია, მხოლოდ სიჩქარე არ შეიძლება დაირღვეს.

ამიტომ, გარკვეული გაგებით, რაც უფრო მოკლეა მოპოვების დრო, მით უკეთესია ნაკრები.Რატომფორეგენინაკრები ხაზს უსვამს სიჩქარეს, რადგან მათ ეს კარგად იციან.

PS: ზოგიერთი გოგონა ატარებს ექსპერიმენტებს ძალიან ფრთხილად, მაგრამ ისინი არ არიან ისეთი კარგი, როგორც სლემ დანკი რამდენიმე წლის მუშაობის შემდეგ.ისინი გრძნობენ, რომ ღმერთი უსამართლოა, სხვებზე წუწუნებს და სიცოცხლეს ეძებს.სინამდვილეში, მას ეს არ ესმოდა.ის კარგად არ იცავდა რნმ-ს და სლემ დანკის მოთამაშე მოხერხებული იყო.როდესაც ექსპერიმენტს ატარებდა, ფიქრობდა, რომ სლემ დანკს სამჯერ, ხუთჯერ და ორი განყოფილებით დაასრულებდა, მაგრამ ექსპერიმენტი კარგად ჩაატარა.

შენიშვნა: უფრო ნელი, RNase შეჭრის მეტი შანსი.როგორ ივარჯიშოთ რომ იყოთ სწრაფი?გზა არ არის, უბრალოდ მეტი ივარჯიშე.

სხვადასხვა ექსპერიმენტებისა და სხვადასხვა ნიმუშებისთვის ჯერ კიდევ საჭიროა მეტი ლიტერატურის წაკითხვა და დამუშავების შესაბამისი მეთოდის არჩევა.ნიმუშების შეგროვებისა და შენახვის პროცესისთვის MIQE მოითხოვს, რომ ის მკაფიოდ იყოს დაწერილი ნაშრომში, რათა რეცენზენტებმა შეძლონ ნაშრომის სანდოობის გადახედვა და ასევე მოსახერხებელია გაოგნებული ახალგაზრდებისთვის თქვენი ექსპერიმენტის გამეორება.

მიუხედავად იმისა, რომ ბიოლოგიური ექსპერიმენტები რთულია, ისინი მაღალი დონისაა.თუ ფრთხილად არ იქნები, შეგიძლია დაამხო სამყარო.მაგალითად, SARS-ის გადაქცევა ბიოქიმიურ კრიზისში, ან ჰიბრიდული ბრინჯის დამზადება 1,3 მილიარდი ადამიანის გადასარჩენად.ქვემოთ მოცემული სურათი არის ქიმიური ექსპერიმენტი, თქვენ უნდა გესმოდეთ, რამდენად ამაყობთ თქვენი გამოკვლევით მხოლოდ მისი დიკის მსგავსი გარეგნობის დათვალიერებით.დაივიწყე, ნუ გააშავებ მას.

MIQE (3) - ნუკლეინის მჟავის ექსტრაქცია.
ნუკლეინის მჟავას მოპოვება დიდი მოვლენაა და ყველა მოლეკულური ბიოლოგიის ექსპერიმენტი იწყება ნუკლეინის მჟავას მოპოვებით.უპირველეს ყოვლისა, მოდით დავაკოპიროთ MIQE-ის შინაარსი ნუკლეინის მჟავას ექსტრაქციაზე.

ამ ფორმის შემხედვარე, ზედაპირზე ვერ დარჩები.ფორმა არის დოგმა.იმისათვის, რომ იყოთ საუკეთესო სტუდენტი, უნდა იკითხოთ რატომ.ამ ცხრილის არსებითი შინაარსია: დადევნერნმ-ის სისუფთავე, მთლიანობა, თანმიმდევრულობა და ექსტრაქციის რაოდენობა .

პირველი ნაწილიპროცესი ან ინსტრუმენტი არის ნუკლეინის მჟავის მოპოვების საფეხური.თუ იყენებთ ნუკლეინის მჟავას ავტომატურ ექსტრაქტორს ამოსაღებად (მოწინავე, გთხოვთ დამიკავშირდეთ შესაძენად), თქვენ უნდა მიუთითოთ ინსტრუმენტის მოდელის სახელი.

ნაკრების დასახელება და

რა ნაკრები იყო გამოყენებული ცვლილების დეტალებისთვის, რა სპეციალური რეაგენტები დაემატა ან რა სპეციალური ოპერაციები გაკეთდა, მკაფიოდ უნდა იყოს ახსნილი, რათა სხვებმა ადვილად გაიმეორონ თქვენი ექსპერიმენტი.

ზოგიერთი ადამიანი სპეციალური ნიმუშების ამოღებისას ამატებს სპეციალურ რეაგენტებს, ფიქრობენ, რომ ეს მათი საიდუმლო იარაღია და სხვებს არ ეუბნებიან.საიდუმლოდ შენახვისას ისინი ასევე კარგავენ თქვენი სტატიის ბრწყინვალების შესაძლებლობას.ნუ იქნები ჭკუა, მეცნიერულ კვლევებში უფრო პატიოსანი უნდა იყო, ვიდრე ქვეყნის ძველ ჟანგს, თუ გინდა იყო ჭკუა, სტატია გაგაბრიყვებს.

უნდა გახსოვდეთ ნაკრების პროდუქტის ნომერიროდესაც თქვენ შეუკვეთავთ კომპლექტს და დაწერთ სტატიას.როგორც წესი, კომპლექტზე ორი ნომერია: Cat - კატალოგის ნომერი (პროდუქტის ნომერი, სტატიის ნომერი), ლოტი - პროდუქტის ლოტის ნომერი ( გამოიყენება იმის დასანიშნად, თუ რომელი პარტიიდან მოვიდა პროდუქტი).

გარდა ამისა, CAS ნომერს ხშირად იყენებენ ბიოქიმიური რეაგენტების შეკვეთისას და მე მას ერთად გავუკეთებ პოპულარიზაციას.CAS ნომერი არის ამერიკული ქიმიური საზოგადოების მიერ მიცემული ნომერი ყოველ ახალ ქიმიურ წამალზე.როგორც წესი, სამი რიცხვი დაკავშირებულია ტირესთან.რუშუის CAS ნომერი: 7732-18-5.ქიმიკატებს ხშირად აქვთ მრავალი მეტსახელი, მაგრამ CAS ნომერი უნიკალურია.წამლის შეკვეთისას შეგიძლიათ ჯერ შეამოწმოთ მისი CAS ნომერი.

სახლთან უფრო ახლოს, რატომ უნდა აღვწეროთ ეს ყველაფერი ნათლად?სინამდვილეში, ეს არის ასევე რნმ-ის ექსტრაქციის ხარისხის შემოწმება.ინსტრუმენტებისა და კომპლექტების გამოყენება რნმ-ის ექსტრაქციას უფრო თანმიმდევრულს გახდის.ჩვეულებრივი ლაბორატორიების მოპოვების მასშტაბი არ არის დიდი და მისი მიღება შესაძლებელია კომპლექტებით.

DNase ან RNase მკურნალობის დეტალები
ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR-ის მნიშვნელოვანი საკითხია დნმ-ის დაბინძურების თავიდან აცილება და ნუ ჩაატარებთ ექსპერიმენტებს, თუ არის დაბინძურება.ამიტომ, აუცილებელია მიუთითოთ პროცესი, რომელიც გამოიყენეთ დნმ-ის დასამუშავებლად, რათა აჩვენოთ, რომ დნმ ექსპერიმენტულ პროცესში მთლიანად და მთლიანად ამოღებულია.წარმოდგენილია სქემატური სქემით.

რნმ-ისა და დნმ-ის სქემატური დიაგრამა
ზოგადად, დნმ-ის ამოღების მეთოდია რნმ-ის მკურნალობა დნაზით ექსტრაქციის შემდეგ.თუმცა, ეს შედარებით ძველი მეთოდებია.კომერციულმა რნმ-ის ექსტრაქციის კომპლექტებმა შეძლეს დნმ-ის ამოღება ექსტრაქციის პროცესში DNase-ის დამატების გარეშე.მაგალითად, კომპლექტების სერია Foregene-სგან.

შენიშვნა: რნმ-ის ექსტრაქციის დროს დნმ-ის ამოღება ძალზე საშიში ორლესლიანი ხმალია, რომელიც გაახანგრძლივებს რნმ-ის ექსტრაქციის მოქმედების დროს და გაზრდის რნმ-ის დეგრადაციის რისკს.ძირითადად, ეს არის კომპრომისი რნმ-ს გამოსავლიანობასა და სიწმინდეს შორის.

გარდა ამისა, სილიციუმზე დაფუძნებული ადსორბციის სვეტში დამატებული DNase-ის რაოდენობა ძალიან მცირეა და ეფექტის მისაღწევად უნდა იქნას გამოყენებული მაღალი ხარისხის DNase.არაოპტიმიზებული DNase ვერ შეიწოვება სწრაფად და სრულად.ეს არის ვაჭრის ტექნიკური დონის ტესტი.რა თქმა უნდა, არსებობენ კიდევ უფრო უცნაური ვაჭრები, რომლებიც ტრაბახობენ, რომ დნმ-ის ამოღება შესაძლებელია DNase-ის გარეშე.შეიძლება ითქვას, რომ ვინც ტრაბახობს, რომ დნმ-ის მთლიანად ამოღება შესაძლებელია DNase-ს გარეშე, არის ხულიგანი.დნმ შედარებით სტაბილური ორჯაჭვიანი სტრუქტურაა და მისი მოსპობა მხოლოდ ლაპარაკით და სიცილით შეუძლებელია.

დაბინძურების შეფასება
შეფასების მეთოდი: ელექტროფორეზის გამოვლენა, 1% აგაროზა, 6 ვ/სმ, 15 წთ, დატვირთვა 1-3 მლ.

ნუკლეინის მჟავის რაოდენობრივი ანალიზი
ჩვეულებრივ იზომება UV სპექტროფოტომეტრის გამოყენებით.ნება მომეცით პირველ რიგში გავავრცელო OD260, OD280 და OD230 სამი მნიშვნელობის მნიშვნელობა.
·OD260nm: ეს არის ნუკლეინის მჟავის უმაღლესი შთანთქმის პიკის შთანთქმის ტალღის სიგრძე და საუკეთესო გაზომილი მნიშვნელობა მერყეობს 0.1-დან 1.0-მდე.თუ არა, განზავდეს ან კონცენტრირება მოახდინოს ნიმუში, რათა ის დიაპაზონში იყოს.
·OD280nm: ეს არის ცილის და ფენოლური ნივთიერებების შთანთქმის უმაღლესი პიკის შთანთქმის ტალღის სიგრძე.
·OD230nm: ეს არის ნახშირწყლების ყველაზე მაღალი შთანთქმის პიკის შთანთქმის ტალღის სიგრძე.

შემდეგი, მოდით ვისაუბროთ თითოეული ინდიკატორის როლზე.A260-ისთვის ის შეიძლება გამოყენებულ იქნას ნუკლეინის მჟავის გამოსავლიანობის გასაზომად.როდესაც OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

სიწმინდისთვის, ჩვენ უნდა შევხედოთ თანაფარდობებს, რომლებსაც ჩვეულებრივ ვხედავთ: OD260/280 და OD260/230.
·სუფთა დნმ: OD260/280 დაახლოებით უდრის 1.8-ს.როდესაც ის 1.9-ზე მეტია, ეს მიუთითებს, რომ არსებობს რნმ-ის დაბინძურება, ხოლო როდესაც ის 1.6-ზე ნაკლებია, მიუთითებს, რომ არსებობს ცილებით და ფენოლებით დაბინძურება.
·სუფთა რნმ: 1.7
·OD260/230: იქნება ეს დნმ თუ რნმ, საცნობარო მნიშვნელობა არის 2.5.როდესაც ის 2.0-ზე ნაკლებია, ეს მიუთითებს იმაზე, რომ არსებობს შაქრის, მარილის და ორგანული ნივთიერებების დაბინძურება.

რნმ მთლიანობა

ძალიან მნიშვნელოვანია რნმ-ის მთლიანობის გაზომვა.ზოგადად, აუცილებელია რნმ-ის დენატურაციის გელის ექსპერიმენტის ჩატარება, რათა შეამოწმოთ არის თუ არა სიკაშკაშე 28S და 18S რნმ-ს შორის ორმაგი კავშირი.როდესაც მესამე ზოლი 5S გამოჩნდება, ეს ნიშნავს, რომ რნმ-მა დაიწყო დეგრადაცია, გარდა უხერხემლოებისა.

მონაცემები რნმ-ის ხარისხის შეფასებისთვის: ზემოაღნიშნული ტესტების გარდა, ასევე არსებობს უფრო მოწინავე ინსტრუმენტული ტესტები რნმ-ის მთლიანობის თვალსაზრისით, როგორიცაა Experion ავტომატური ელექტროფორეზის სისტემის RQI მთლიანობის ტესტი, რომელსაც შეუძლია აღმოაჩინოს რნმ-ის დეგრადაცია უხილავად.

სამეცნიერო კვლევებში, ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR არის შედარება სამიზნე გენსა და შიდა საცნობარო გენს შორის.ამრიგად, რნმ-ის ნიმუშის შენარჩუნების, რნმ-ის ექსტრაქციის და ა.შ. პროცესში, მთავარი მიზანია რნმ-ის მთლიანობის უზრუნველყოფა.

როგორ მოქმედებს რნმ-ის მთლიანობა სამიზნე გენსა და შიდა საცნობარო გენს შორის ბალანსზე, ადვილად გასაგებია ქვემოთ მოცემული ფიგურიდან.დეგრადაცია გამოიწვევს გენის არასრულყოფილებას, იქნება ეს შიდა საცნობარო გენის არასრულყოფილება თუ სამიზნე გენის არასრულყოფილება, ეს დიდ გავლენას მოახდენს მონაცემებზე.

სამიზნე გენის და საცნობარო გენის სქემატური დიაგრამა არ უნდა იყოს ჭეშმარიტი

ინჰიბიციის ტესტი (იქნება თუ არა CT მნიშვნელობა დათრგუნული მაღალი ან დაბალი კონცენტრაციის ან სხვა პირობებში)

ამ ფიგურის მაგალითის მიღებით, ხუთი მრუდის Ct მნიშვნელობები შემდეგია.CT მნიშვნელობების განაწილება მრუდებს შორის არათანაბარია და Ct მნიშვნელობები შეფერხებულია მაღალი და დაბალი კონცენტრაციების პირობებში, რაც არის PCR ინჰიბიციის შემთხვევაში.

საკვანძო მომენტი: რნმ-ის ექსტრაქციის პროცესში ჩვენ უნდა მივატოვოთ მცდარი წარმოდგენები და დავადგინოთ სწორი.

მცდარი აზრია: რნმ-ის ექსტრაქცია მხოლოდ მოსავლიანობას მიჰყვება, თუ ფიქრობთ, რომ რაც უფრო დიდია მიღებული რნმ-ის რაოდენობა, მით უკეთესი.სინამდვილეში, როდესაც ვაკეთებთ რაოდენობებს, თუ გენების რაოდენობა არ არის ძალიან დიდი, ჩვენ არ გვჭირდება ბევრი რნმ.თქვენ მიერ ამოღებული რნმ-ის რაოდენობა საკმარისზე მეტია.

სწორი კონცეფციაა:რნმ-ის ექსტრაქცია უნდა ატარებდეს სიწმინდეს, მთლიანობას და თანმიმდევრულობას.სიწმინდეს შეუძლია უზრუნველყოს, რომ შემდგომი საპირისპირო ტრანსკრიფცია არ იქნება დათრგუნული და მონაცემებზე გავლენას არ მოახდენს დნმ.მთლიანობა უზრუნველყოფს სამიზნე თანმიმდევრობებისა და შიდა მითითებების ბალანსს.თანმიმდევრულობა უზრუნველყოფს ნიმუშის სტაბილურ დატვირთვას.

MIQE (4) – საპირისპირო ტრანსკრიფცია
მცდარი წარმოდგენა: ნიმუშის უფრო მაღალი მოცულობის დევნა.
სწორი კონცეფცია: დაიცავით თანმიმდევრულობა (სტაბილურობა), დატვირთული რნმ-ის რაოდენობის მიუხედავად, საპირისპირო ტრანსკრიფციის ეფექტურობა რჩება თანმიმდევრული, რაც უზრუნველყოფს, რომ cDNA-ში განსხვავებები ნამდვილად ასახავს mRNA-ში არსებულ განსხვავებებს.
ჩვენ ავხსნით ამ პროცესს სქემატური სქემით:

საპირისპირო ტრანსკრიფციის ეფექტურობის სქემატური დიაგრამა არ შეესაბამება სიმართლეს
უპირველეს ყოვლისა, ჩვენ უნდა გვესმოდეს განსხვავება საპირისპირო ტრანსკრიფციის პროცესსა და PCR პროცესს შორის.PCR გადის მრავალჯერადი გაცხელების და ანეილირების პროცესს და სამიზნე ფრაგმენტი ექსპონენტურად იზრდება;მიუხედავად იმისა, რომ საპირისპირო ტრანსკრიფციას არ აქვს ეს პროცესი, ჩვენ შეგვიძლია წარმოვიდგინოთ, რომ საპირისპირო ტრანსკრიფცია რეალურად არის ერთი-ერთზე რეპლიკაციის პროცესში, რნმ-ის იმდენივე ცალი.

რამდენადაც შესაძლებელია cDNA ინფორმაციის იმდენი ნაწილის მიღება, ეს უკვე გასაგები უნდა იყოს, რადგან დიდი და პატარა ფრაგმენტები გადაწერილია და შეუძლებელია ერთ ფრაგმენტზე ფოკუსირება.და რადგანაც რნმ-ის რაოდენობა შედარებით მცირეა, მიღებული cDNA-ის რაოდენობაც შედარებით მცირეა, PCR-ისგან განსხვავებით, რომელსაც აქვს ამპლიფიკაციის ეფექტი, ამიტომ მისი აღმოჩენა ძირითადად შეუძლებელია.

cDNA ელექტროფორეზის შედეგები
მეორეც, იდეალურ შემთხვევაში, საპირისპირო ტრანსკრიფცია ხორციელდება ერთი-ერთზე, მაგრამ ვერც ერთი კომპანიის საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა ვერ მიაღწევს ამ ეფექტს.ძირითადად, საპირისპირო ტრანსკრიპტაზების უმრავლესობის ეფექტურობა 30-50%-ს შეადგენს.თუ ეს ასეა, ჩვენ მირჩევნია გვქონდეს შედარებით სტაბილური საპირისპირო ტრანსკრიფციის ეფექტურობა, რაც გვინდა ვიხილოთ სურათზე: 3 რნმ იღებს 2 cDNA-ს, 6 რნმ იღებს 4 cDNA-ს, ასე რომ, რაც არ უნდა დატვირთული იყოს ნიმუში, საპირისპირო ტრანსკრიფციის ეფექტურობა შედარებით სტაბილურია.ჩვენ არ გვინდა დავინახოთ სიტუაცია, სადაც საპირისპირო ტრანსკრიფციის ეფექტურობა არასტაბილურია და მაღალი კონცენტრაცია დათრგუნულია.

მაშ, როგორ შევამოწმოთ არის თუ არა საპირისპირო ტრანსკრიფციის ეფექტურობა სტაბილური?მეთოდი ძალიან მარტივია, საჭიროა მხოლოდ შედარების ტესტის გაკეთება: ერთი არის შებრუნებული ტრანსკრიფცია cDNA-ში რნმ-ის გაორმაგების შემდეგ და მეორე არის გაორმაგება განზავება cDNA-ში შებრუნებული ტრანსკრიფციის შემდეგ და შემდეგ გააკეთეთ qPCR, რომ ნახოთ მიღებული დახრილობა შეესაბამება თუ არა.როგორც საუკეთესო სტუდენტი, თქვენ უნდა გაიგოთ ეს წამებში.Როგორც ქვემოთაა ნაჩვენები:

რნმ-ისა და cDNA-ს განზავება, რათა შეამოწმოს არის თუ არა საპირისპირო ტრანსკრიფციის ეფექტურობა
საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა და ნაკრები
როგორ შეიძლება სრულყოფილი ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR ჰქონდეს შესანიშნავი საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა და ნაკრები.საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა წყაროს მიხედვით უხეშად იყოფა ორ ტიპად, AMV ანM-MLVდა მათი შესრულება იგივეა, რაც ცხრილშია ნაჩვენები.

RNase H აქტივობა
RNase H არის რიბონუკლეაზა H, ჩინური სახელია რიბონუკლეაზა H, რომელიც არის ენდორიბონუკლეაზა, რომელსაც შეუძლია რნმ-ის სპეციალურად ჰიდროლიზება დნმ-რნმ ჰიბრიდულ ჯაჭვში.RNase H არ შეუძლია ფოსფოდიესტერის ობლიგაციების ჰიდროლიზირებას ერთჯაჭვიანი ან ორჯაჭვიანი დნმ-ის ან რნმ-ში, ანუ მას არ შეუძლია დაიღუპოს ერთჯაჭვიანი ან ორჯაჭვიანი დნმ ან რნმ.ჩვეულებრივ გამოიყენება cDNA-ს მეორე ჯაჭვის სინთეზში.

უცნაური რამ არის.ჩვენ ვამბობთ, რომ საპირისპირო ტრანსკრიპტაზას აქვს RNase H აქტივობა და არა ის, რომ საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა შეიცავს RNase H-ს და შეიძლება შეუძლებელი იყოს RNase H-ის გამოყოფა უკუ ტრანსკრიპტაზასგან, შესაძლოა, გარკვეული ჯგუფების კონფორმაციის გამო უკუ ტრანსკრიპტაზაში. ეს აქტივობა გამოწვეულია უკუ ტრანსკრიპტაზათ.

ამიტომ, მიუხედავად AMV-ის უკუ ტრანსკრიფციის მაღალი ეფექტურობისა, მისი RNase H აქტივობა ამცირებს cDNA-ს გამომუშავებას.რა თქმა უნდა, რეაგენტების მწარმოებლები მუდმივად ახდენენ თავიანთი პროდუქტების ოპტიმიზაციას, რათა მაქსიმალურად აღმოიფხვრას RNase H აქტივობა საპირისპირო ტრანსკრიპტაზაში, რათა გაზარდონ cDNA-ს გამოსავლიანობა.
ანეილირების ტემპერატურა

რნმ-ის მეორადი სტრუქტურა სხვადასხვა ტემპერატურაზე
იხილეთ ზემოთ ნახაზი რნმ-ის მეორადი სტრუქტურისთვის სხვადასხვა ტემპერატურაზე და გამოიყენეთ mFold ონლაინ ინსტრუმენტი სამიზნე ფრაგმენტის მეორადი სტრუქტურის დასადგენად სპეციფიკური ტემპერატურისა და მარილის კონცენტრაციის პირობებში.55°C-ზე რნმ-ის მეორადი სტრუქტურა ჯერ კიდევ ძალიან რთულია, საპირისპირო ტრანსკრიპტაზას არ შეუძლია მუშაობა და მეორადი სტრუქტურის სრულად ამოხსნა შეუძლებელია 65°C-მდე, ხოლო AMV და M-MLV-ის ოპტიმალური ტემპერატურა ამ ტემპერატურაზე ბევრად დაბალია.
რა უნდა ვქნა?მეორადი სტრუქტურა არის თავად შაბლონის დამატებითი დაწყვილება, რაც იწვევს ძლიერ კონკურენციას პრაიმერსა და საპირისპირო ტრანსკრიპტაზასა და შაბლონს შორის, რაც იწვევს უამრავ პრობლემას, როგორიცაა დაბალი E და ცუდი განმეორებადობა.

რა უნდა ვქნა?მაქსიმალურად გაზარდეთ დუღილის ტემპერატურა.

რეაგენტების მრავალი მწარმოებელი აუმჯობესებს თავის საპირისპირო ტრანსკრიპტაზას გენეტიკური ინჟინერიის საშუალებით.ზოგი ზრდის რეაქციის ტემპერატურას, როგორიცაა ჯიფანი და აიდელაი, ზოგი კი ხსნის RNase H ფერმენტის აქტიურ ჯგუფს ფერმენტსა და რნმ-ის შაბლონს შორის კავშირის გასაუმჯობესებლად.მაღალ აფინურობას შეუძლია კონკურენტულად შეასუსტოს მეორადი სტრუქტურა და შეუფერხებლად წაიკითხოს, ასევე მნიშვნელოვნად გააუმჯობესოს საპირისპირო ტრანსკრიფციის ეფექტურობა.
საკვანძო წერტილი: საპირისპირო ტრანსკრიფცია უფრო მნიშვნელოვანია საპირისპირო ტრანსკრიფციის ეფექტურობის თანმიმდევრულობის მისაღწევად (ფერმენტები უნდა იყოს არა მხოლოდ ეფექტური, არამედ სტაბილური), ვიდრე დატვირთული ნიმუშის რაოდენობა, თუ ეს არ არის განსაკუთრებით ფართომასშტაბიანი ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR, ეს საერთოდ შეუძლებელი იქნება.მრავალი cDNA.
სხვადასხვა მწარმოებლებმა ასევე გააკეთეს გარკვეული ძალისხმევა თანმიმდევრულობის მისაღწევად.მაგალითად, კომპანიების უმეტესობამ ახლა უკვე შეფუთულია საპირისპირო ტრანსკრიფცია, როგორც სტანდარტული ნაკრები გასაყიდად, რაც კარგი არჩევანია.
მაგალითად, Foregene-ის RT Easy Series კომპლექტები:

RT Easy I (მასტერ პრემიქსი პირველი ჯაჭვის cDNA სინთეზის ნაკრებისთვის)

MIQE (5) - სამიზნე გენის ინფორმაცია

ზემოთ მოყვანილი ფიგურა განმარტავს
1. ეფექტურია თუ არა ეს გენი განმეორებითი ექსპერიმენტებისთვის, ზოგადად შეიძლება დადასტურდეს განმეორებითი ექსპერიმენტებით.
2. გენის ID, თქვენ იცით.
3. გენის სიგრძე, სამიზნე გენის მთლიანი სიგრძე ნამდვილად არ არის პრობლემა.პრაიმერების დიზაინის დროს, დარწმუნდით, რომ ამპლიკონის სიგრძე იყოს 80-200bp-მდე, რათა უზრუნველყოთ უკეთესი გამაძლიერებელი ეფექტურობა.
4. Sequence Blast-ის შედარების ინფორმაცია, სამიზნე გენი საჭიროებს შედარებას გენბანკში არასპეციფიკური გაძლიერების თავიდან ასაცილებლად.
5. ფსევდოგენების არსებობა.ფსევდოგენი არის დნმ-ის თანმიმდევრობა ნორმალური გენის მსგავსი, მაგრამ კარგავს თავის ნორმალურ ფუნქციას.ის ხშირად გვხვდება ევკარიოტების მრავალგენიან ოჯახში.ის ჩვეულებრივ წარმოდგენილია ψ.ეს არის არაფუნქციური გენომული დნმ-ის ასლი გენომში, რომელიც ძალიან ჰგავს კოდირების გენის თანმიმდევრობას., ზოგადად არ არის გადაწერილი და არ აქვთ მკაფიო ფიზიოლოგიური მნიშვნელობა.
6. პრაიმერების პოზიცია ეგზონებთან და ინტრონებთან შედარებით.ადრეულ წლებში, როდესაც ჩვენ გადავჭრით დნმ-ის დაბინძურების პრობლემას, ჩვენ ხშირად ვაქცევდით ყურადღებას პრაიმერების, ეგზონების და ინტრონების პოზიციებს და ზოგადად განვიხილავდით პრაიმერების დაპროექტებას ინტრონების გასწვრივ, რათა თავიდან ავიცილოთ დნმ-ის გაძლიერება.გთხოვთ, იხილოთ ქვემოთ მოყვანილი ფიგურა: შავი წარმოადგენს ინტრონებს, სხვადასხვა ცისფერი წარმოადგენს ეგზონებს, ვარდისფერი წარმოადგენს ჩვეულებრივ პრაიმერებს და ნათელი წითელი წარმოადგენს ინტრონიან პრაიმერებს.

სქემატური, არასოდეს მართალია
რა იდეალურად გამოიყურება ეს გეგმა, მაგრამ სინამდვილეში, უმეტეს შემთხვევაში, ტრანსინტრონის პრაიმერები არ არის ისეთი ჯადოსნური, როგორც წარმოგვიდგენია და ისინი ასევე იწვევენ არასპეციფიკურ გაძლიერებას.ასე რომ, დნმ-ის დაბინძურების თავიდან ასაცილებლად საუკეთესო გზაა დნმ-ის მთლიანად ამოღება.
7. კონფორმაციის პროგნოზირება.ამ მაგალითის კიდევ ერთხელ გამოყენებით, გამოიყენეთ mFold ონლაინ ინსტრუმენტი სამიზნე ფრაგმენტის მეორადი სტრუქტურის დასადგენად კონკრეტულ ტემპერატურაზე და მარილის კონცენტრაციაზე.

რნმ-ის მეორადი სტრუქტურა სხვადასხვა ტემპერატურაზე
მეორადი სტრუქტურა არის თავად შაბლონის დამატებითი დაწყვილება, რაც გამოიწვევს ძლიერ კონკურენციას პრაიმერისა და შაბლონის დაწყვილებას შორის, ხოლო პრაიმერის დაკავშირების შანსი ნაკლებია, რაც გამოიწვევს პრობლემების სერიას, როგორიცაა დაბალი E და ცუდი განმეორებადობა.პროგრამული პროგნოზის საშუალებით, თუ არ არის მეორადი სტრუქტურის პრობლემა, ეს შესანიშნავი იქნება.თუ არსებობს, ჩვენი შემდგომი სტატია კონკრეტულად განიხილავს, თუ როგორ უნდა მოგვარდეს ეს პრობლემა.

MIQE (6) - qPCR ოლიგონუკლეოტიდები

ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR-ისთვის, პირველი, რასაც ყოველდღე ებრძვით, არის რნმ-ის ექსტრაქცია და მეორე შეიძლება იყოს პრაიმერის დიზაინი.
უპირველეს ყოვლისა, ჩვენ კვლავ ვამოწმებთ პრაიმერის დიზაინის წესებს MIQE სიის მიხედვით.ეს იმდენად მარტივია, რომ ნაძირლებს შეუძლიათ სიცილი და ჩვენ შეგვიძლია დავასრულოთ ეს ერთი წინადადებით: გავარკვიოთ პრაიმერის ზონდის თანმიმდევრობა და პოზიცია და მოდიფიკაციის მეთოდი.პრაიმერის გაწმენდის მეთოდისთვის, პრაიმერის სინთეზი ამჟამად იმდენად იაფია, qPCR იმსახურებს PAGE და ზემოთ გამწმენდი მეთოდებს და სინთეზის ინსტრუმენტის ინფორმაცია არ არის მნიშვნელოვანი.ბევრი ადამიანი აკეთებს პრაიმერებს ათწლეულების განმავლობაში და არ იცის, რომ სინთეზატორი არის ABI3900.
რაც შეეხება პრაიმერის დიზაინის პრინციპებს, თქვენ არ გჭირდებათ მათი ზეპირად დამახსოვრება, რადგან პრაიმერის დიზაინის პროგრამულ უზრუნველყოფას ან ონლაინ ინსტრუმენტებს შეუძლიათ ამ პრობლემების მოგვარება (რეკომენდირებულია ონლაინ ინსტრუმენტი primer3.ut.ee/), ხოლო პრაიმერის დიზაინის 99,999% ხელით არ კეთდება.
უბრალოდ შეამოწმეთ შემდეგი პუნქტები პრაიმერების დაპროექტების შემდეგ:
1. დიზაინის პრაიმერები 3' ბოლოსთან ახლოს: cDNA-ს პირველი ჯაჭვის სინთეზისთვის ოლიგო dT პრაიმერების გამოყენების შემთხვევაში, საპირისპირო ტრანსკრიფციის ეფექტურობისა და რნმ-ის მთლიანობის გათვალისწინებით, დაპროექტებული პრაიმერები უნდა იყოს დაპროექტებული 3' ბოლოსთან ახლოს, გაძლიერების ეფექტურობის გასაუმჯობესებლად.გამოიყენეთ სურათი შემდეგნაირად ასახსნელად (ამის გაგების გზა არ არსებობს):

რატომ უნდა იყოს დაპროექტებული პრაიმერები 3′ ბოლოსთან ახლოს, ეს არ უნდა იყოს სიმართლე
2. TM მნიშვნელობა: Tm მნიშვნელობა არის 55-65°C-ზე (რადგან ეგზონუკლეაზას აქტივობა ყველაზე მაღალია 60°C-ზე), ხოლო GC შემცველობა არის 40%-60%.
3. BLAST: იმისათვის, რომ თავიდან ავიცილოთ გენომის არასპეციფიკური გაძლიერება, Blast უნდა იქნას გამოყენებული დამატებითი შემოწმებისთვის.

MIQE (7) - qPCR პროცესი

1. qPCR ნაკრები
MIQE-ის მოთხოვნების მიხედვით, სტატიაში ნათლად უნდა აღვწეროთ რეაქციის სრული პირობები, მათ შორის PCR რეაქციის სისტემის კონფიგურაცია, რა ნაკრები გამოიყენება, ვინ არის მწარმოებელი, რამდენად დიდია რეაქციის სისტემა, გამოყენებულია საღებავის მეთოდი თუ გამოძიების მეთოდი, PCR პროგრამის პარამეტრები.ვეტერანი მძღოლები აუცილებლად აღმოაჩენენ, რომ სანამ ნაკრები შეირჩევა, ზემოაღნიშნული ინფორმაცია ძირითადად განისაზღვრება.
ამჟამად, ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR კომპლექტების წარმოება და წარმოება ძალიან მომწიფებული ტექნოლოგიაა.სანამ არ აირჩევთ უკიდურესად ცუდ მწარმოებლებს, პრობლემების ალბათობა დიდი არ არის, მაგრამ ჩვენ მაინც გვინდა გაგიზიაროთ რამდენიმე პუნქტი:
ცხელი დაწყების Taq ფერმენტი:PCR-ის ყველაზე მნიშვნელოვანი ნაწილია ცხელი დაწყების Taq ფერმენტი.ბაზარზე არსებული ცხელი დაწყების ფერმენტები ზოგადად იყოფა ორ ტიპად, ერთი არის ქიმიურად მოდიფიცირებული ცხელი დაწყების ფერმენტი (შეგიძლიათ წარმოიდგინოთ, როგორც პარაფინის ჩანერგვა), ხოლო მეორე არის ცხელი დაწყების ფერმენტი ანტისხეულების მოდიფიკაციისთვის (ანტიგენ-ანტისხეულის შეკავშირება).ქიმიური მოდიფიკაცია არის ფერმენტების ცხელი დაწყების ადრეული გზა.როდესაც გარკვეული ტემპერატურა მიიღწევა, ფერმენტი გაათავისუფლებს თავის აქტივობას.ანტისხეულებით მოდიფიცირებული ცხელი დაწყების ფერმენტი იყენებს ბიოლოგიურ მეთოდებს ფერმენტის აქტივობის დასაბლოკად.როდესაც გარკვეულ ტემპერატურას მიაღწევს, ანტისხეული დენატურირებული და ინაქტივირებული იქნება პროტეინის სახით და ფერმენტის აქტივობა ამოქმედდება.

თუმცა რა სარგებლობა მოაქვს ამას?ეს ასეა, ანტისხეულებით მოდიფიცირებული ფერმენტების გამოთავისუფლების აქტივობა უფრო სწრაფია, ვიდრე ქიმიურად მოდიფიცირებული ფერმენტების, ამიტომ მგრძნობელობის თვალსაზრისით, ანტისხეულებით მოდიფიცირებულ ფერმენტებს აქვთ მცირე უპირატესობა, ასე რომ, ძირითადად, არ არის ქიმიურად მოდიფიცირებული ფერმენტები ბაზარზე.თუ არსებობს, მაშინ ამ მწარმოებლის ტექნოლოგია ჯერ კიდევ ათასწლეულის ეპოქაშია ჩარჩენილი.
მაგნიუმის იონის კონცენტრაცია:მაგნიუმის იონების კონცენტრაცია ძალიან მნიშვნელოვანია PCR რეაქციაში.მაგნიუმის იონების სათანადო კონცენტრაციამ შეიძლება ხელი შეუწყოს Taq ფერმენტის აქტივობის განთავისუფლებას.თუ კონცენტრაცია ძალიან დაბალია, ფერმენტის აქტივობა მნიშვნელოვნად შემცირდება;თუ კონცენტრაცია ძალიან მაღალია, ფერმენტის მიერ კატალიზებული არასპეციფიკური გაძლიერება გაძლიერდება.მაგნიუმის იონების კონცენტრაცია ასევე იმოქმედებს პრაიმერების დუღილზე, შაბლონის დნობის ტემპერატურაზე და PCR პროდუქტების ხარისხზე, რითაც იმოქმედებს გაძლიერებული ფრაგმენტების გამოსავლიანობაზე.მაგნიუმის იონების კონცენტრაცია ზოგადად კონტროლდება 25 მმ-ზე.რა თქმა უნდა, კარგი ნაკრებისთვის, მაგნიუმის იონების კონცენტრაცია კარგად უნდა იყოს კონტროლირებადი.ზოგიერთი ვაჭარი ამატებს რეაგენტს მაგნიუმის იონის ქელატირებელ აგენტს, რომელსაც შეუძლია მიაღწიოს მაგნიუმის იონის კონცენტრაციის ავტომატური კორექტირების ეფექტს.
ფლუორესცენტური საღებავის კონცენტრაცია:ფლუორესცენტული საღებავი, რომელიც არის SYBR მწვანე, რომელსაც ჩვეულებრივ ვიყენებთ, ძირითადად წარმოქმნის ფლუორესცენტს ორმაგი დნმ-ის მცირე გროვთან სავალდებულო გზით, რადგან საღებავის ორმაგად დნმ-ზე დნმ-ს აკავშირებს არ არის სპეციფიკური, ანუ, რამდენადაც ორმაგი სტრიქონის დნმ-სთან ერთად ხდება მასთან, ასე რომ, ფუგორესცენტი შეიძლება მოხდეს, ასე რომ, ფუგორესცენტი შეიძლება მოხდეს, ასე რომ, ფუგორესცენტი შეიძლება მოხდეს, ასე რომ, დნმ-ის დნმ-ის წმინდაა.
PS: სინათლისადმი მგრძნობიარე თვისებების გამო, ბაზარზე არსებული პროდუქტები ძირითადად შეფუთულია ყავისფერი გაუმჭვირვალე ცენტრიფუგის მილებში (როგორც ნაჩვენებია ქვემოთ მოცემულ სურათზე).თუმცა ეს პრობლემას შეექმნება.ძნელია იმის დანახვა, იწოვება თუ არა სითხე სინჯის აღებისას.ამ მხრივ, Qingke მართლაც ყველაზე მოსახერხებელია მომხმარებლისთვის (როგორც ნაჩვენებია ქვემოთ მოცემულ სურათზე), ხოლო გამჭვირვალე მილი შეფუთულია გაუმჭვირვალე თუნუქის ჩანთაში.შემდეგ ჩადეთ იგი თუნუქის ჩანთაში, სინათლისა და სინჯების თავიდან აცილების მოხერხებულობის გათვალისწინებით.თქვენ უნდა აირჩიოთ პროდუქტის სწორი ნომერი.TSE204 არის სუპერ ეკონომიური არსებობა, რაც მაიძულებს ბალახის დარგვას.

ასევე ძალიან მნიშვნელოვანია ფლუორესცენტური საღებავის კონცენტრაცია.თუ კონცენტრაცია ძალიან დაბალია, ამპლიფიკაციის მრუდი არ გაიზრდება შემდგომ ეტაპზე და არ არის სრულყოფილი;თუ კონცენტრაცია ძალიან მაღალია, ეს გამოიწვევს ხმაურის ჩარევას.ვინაიდან ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR ძირითადად დამოკიდებულია CT მნიშვნელობაზე, თუ ფლუორესცენტური საღებავის კონცენტრაცია სწორად არ არის მორგებული, დაბალი წერტილი უკეთესია, ვიდრე მაღალი.რა თქმა უნდა, საღებავის შესაბამისი კონცენტრაცია საუკეთესოა.

ROX: ROX საღებავები გამოიყენება ფლუორესცენციის სიგნალის შეცდომების გამოსასწორებლად.ზოგიერთი ინსტრუმენტის მწარმოებელი მოითხოვს კალიბრაციას, ზოგი კი არა.მაგალითად, Thermo Fisher Scientific-ის Real Time PCR გამაძლიერებელი ინსტრუმენტის გამოყენება ჩვეულებრივ მოითხოვს კალიბრაციას, მათ შორის 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus და ა.შ. ზოგადი ნაკრების ინსტრუქციები აღწერს მას.
Foregene-ის qPCR Mix ასევე შეიცავს ROX საღებავს, რომელიც მოსახერხებელია სხვადასხვა მოდელებში გამოსაყენებლად.

რეალურ დროში PCR Kit-Taqman

სუსტი წყალბადის ბმის მკურნალობა: წყალბადის სუსტი ბმების დამუშავება შედარებით ტექნიკური საკითხია.ბევრი კომპლექტის სახელმძღვანელო არავის წაუკითხავს, ​​მაგრამ არცერთ მათგანს არ უხსენებია ეს თემა.სინამდვილეში, ეს ძალიან მნიშვნელოვანია.ფუძეების ერთობლიობა ძირითადად დამოკიდებულია წყალბადის ბმების სიძლიერეზე.ძლიერი წყალბადის ბმები არის ნორმალური გაძლიერება, ხოლო სუსტი წყალბადის ბმები იწვევს არასპეციფიკურ გაძლიერებას.თუ სუსტი წყალბადის ბმები კარგად ვერ აღმოიფხვრება, არასპეციფიკური გაძლიერება ვერ იქნება აცილებული.ავტორის ფარგლებში, მხოლოდ რამდენიმე კომპანიამ შეამჩნია ეს პრობლემა.ნაკრების შეძენისას შეგიძლიათ მიუთითოთ, განიხილეთ თუ არა გამოსავალი ამ მხრივ იმ ნაკრებისთვის, რომლის არჩევაც გსურთ.

რეაქციის მოცულობა: 20-50 ულტრა სისტემა უფრო ხშირად გამოიყენება და მცირე მოცულობებმა შეიძლება გამოიწვიოს შეცდომები.ზოგადად, ნაკრების ინსტრუქციებში რეკომენდებულია PCR რეაქციის მოცულობების გამოყენება.ნუ იქნებით ჭკვიანები და ხარჯების დაზოგვის მიზნით გამოიყენეთ უფრო მცირე მოცულობები.მიზანი.ვაჭრების მიერ რეკომენდირებული მოცულობა ფაქტობრივად შემოწმებულია და შესაძლოა მათ ვერ გადაჭრას მცირე მოცულობით გამოწვეული შეცდომების პრობლემა.
2. მილის ფირფიტის მწარმოებელი და პროდუქტის ნომერი
ყველამ იცის ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR-ის პრინციპი.ფლუორესცენციის შეგროვება ძირითადად PCR მილის ხუფების მეშვეობით ხდება.PCR სახარჯო მასალის არჩევისას ყურადღება მიაქციეთ ორ პუნქტს: კარგი სინათლის გადაცემა და ხელსაწყოსათვის შესაფერისი.ზოგადად რომ ვთქვათ, მეინსტრიმ ბრენდების დაფები და მილები კარგია, მაგრამ ადაპტაციის კუთხით ფრთხილად უნდა აირჩიოთ, წინააღმდეგ შემთხვევაში ინსტრუმენტს ვერ გამოიყენებთ.

4. უმაღლესი დონის ცოდნა

MIQE (8) - qPCR ვალიდაცია
ეს არის qPCR-ის მთავარი პრიორიტეტი!ამდენი გმირი აქ ქვიშაში ჩავარდა.რა თქმა უნდა, ასევე შესაძლებელია, რომ გაგიმართლოთ და გენები, რომლებიც შეისწავლეთ, მარტივია, ამიტომ ქარის გასწვრივ ყინულის გამოქვაბულში გაცურეთ.qPCR-ის გადამოწმების ინფორმაცია გამიზნულია მონაცემთა სანდოობის შესამოწმებლად.ჩვენ ჩამოვთვლით საჭირო გადამოწმების ინფორმაციას შემდეგნაირად:

1.სპეციფიკურობის ტესტი
სამიზნე გენის ამპლიფიკაციის სპეციფიკა მოწმდება იმის შემოწმებით, არის თუ არა ელექტროფორეზის სურათი ერთი ზოლი;თანმიმდევრობის გადამოწმება;დნობის მრუდი იმის დასანახად, არის თუ არა პიკის რუკა ერთჯერადი;ფერმენტების მონელების შემოწმება და სხვა მეთოდები.
აქ ჩვენ ყურადღებას ვამახვილებთ ტარასპეციფიკური გაძლიერების ანალიზი დნობის მრუდების მეთოდით.ზოგადად რომ ვთქვათ, როდესაც ჩვენ ვქმნით პრაიმერებს, პროდუქტის ფრაგმენტის ზომა უნდა იყოს 80-200bp დიაპაზონში, რაც აქცევს PCR პროდუქტის დნობის ტემპერატურას 80-85 °C დიაპაზონში.ამიტომ, თუ არსებობს სხვადასხვა მწვერვალები, უნდა იყოს სხვა არასპეციფიკური გამაძლიერებელი პროდუქტები;თუ პიკი გამოჩნდება 80°C-ზე დაბლა, ის ზოგადად ითვლება პრაიმერის დიმერად;თუ პიკი გამოჩნდება 85°C-ზე მაღლა, ეს ჩვეულებრივ ითვლება დნმ-ის დაბინძურებად ან დიდი ფრაგმენტების უფრო არასპეციფიკურ გაძლიერებად.
შენიშვნა: ზოგჯერ არის მხოლოდ ერთი პიკი 80°C-ზე.ამ დროს ეს კონცეფცია უნდა დაიცვან.სავარაუდოა, რომ გაძლიერების შედეგები ყველა პრაიმერის დიმერია.

ნორმალური დნობის მრუდი (ერთი პიკი არასპეციფიკური გაძლიერების გარეშე)

პრობლემური დნობის მრუდი (ყალბი მწვერვალების არასპეციფიკური გაძლიერება)
【საქმის ანალიზი】

არის მთავარი პიკი, მაგრამ პრაიმერის დიმერი სერიოზულია
ქვემოთ მოცემულ ფიგურაში ერთი მწვერვალის დნობის მრუდი ადვილად მოატყუებს თქვენს თვალებს, ფიქრობენ, რომ ეს შესანიშნავი ექსპერიმენტია, მაგრამ შედეგი სრულიად არასწორია.ამ დროს უნდა მივხედოთ დნობის ტემპერატურას.პიკური ტემპერატურა 80°C-ზე დაბალია, რაც მთლიანად პრაიმერ-დიმერია.

არ არის სამიზნე ფრაგმენტი, ყველა პრაიმერის დიმერი
აი, ჩემი ძმა ვერ ჩერდება.ქვემოთ მოცემული სურათი არის მობილური ტელეფონით გადაღებული ფოტო, რომელიც გამომიგზავნა ნაძირალამ.რეაგენტები, რომლებიც მან გამოიყენა, არის ინდუსტრიაში ხშირად გამოყენებული ბრენდები.ის შეიცვალა ერთი T-prefix ბრენდიდან მეორე T-prefix ბრენდით.მგონი უკვე გამოიცანით.ნაძირალამ წამოიძახა: „პირველ სურათზე გამოყენებული რეაგენტი ძალიან კარგია, პიკი კი ერთია.მოგვიანებით, თქვენ მიერ რეკომენდებული რეაგენტის გამოყენების შემდეგ, ის ხდება მეორე სურათის მსგავსი, შერეული მწვერვალებით.შენ გამაუბედურე."
გამოყავით ორი გრაფიკი.ერთი შეხედვით, ერთს აქვს ერთი მწვერვალი, მეორეს კი ორმაგი მწვერვალი.სისულელეა, ერთი მწვერვალი რა თქმა უნდა კარგია.ეს მართალია?
Dou E-ზე უარესი, ქვემოთ სურათზე ორი სურათი რომ დავდო, მაშინვე მიხვდებით.სინამდვილეში, ჩვენ ადვილად პარალიზებულები ვართ ამ სახის სურათით.საგულდაგულო ​​ანალიზის შემდეგ აღმოვაჩინეთ, რომ: პირველი ფიგურის პიკი არის 75°C, რომელიც მთლიანად პრაიმერის დიმერია;მეორე ფიგურის პიკი ჩანს 75°C-ზე და 82°C-ზე, სულ მცირე არის პროდუქტი ჩნდება.

სტუდენტების გამოხმაურების სურათები
ასე რომ, ფუნდამენტური პრობლემა არ არის რეაგენტების პრობლემა, არამედ პრაიმერის დიზაინის პრობლემა.ამავდროულად, ეს ასევე ადასტურებს, რომ ზოგიერთი დიდი ბრენდი არ არის რკინის ხარისხის და ასევე ადასტურებს იმას, რაც ჩემმა ძმამ თქვა ადრე: ეს არ არის რეაგენტის ბრენდი, რომელიც მხარს უჭერს თქვენს სტატიას.ეს არის თქვენი სტატია, რომელმაც გააძლიერა რეაგენტების ბრენდი.წარმოიდგინეთ, ნაძირალას რეაგენტები რომ არ შეეცვალა, ჟურნალში არასწორი მონაცემები გაიგზავნება და რაც მოხდებოდა, ტრაგედია იქნებოდა.
2. ცარიელი კონტროლის Ct მნიშვნელობა
არ ამიხსნათ, თუ ცარიელ კონტროლს აქვს Ct მნიშვნელობა, ეს არ არის დაბინძურება?თუმცა, თქვენ მაინც უნდა გესმოდეთ, რომელ ცარიელ კონტროლს აქვს Ct მნიშვნელობა.თუ ეს არის NTC, ეს ნიშნავს, რომ არსებობს უცხო დნმ, როგორიცაა რეაგენტით დაბინძურება.თუ ეს არის NRT, ეს ნიშნავს, რომ ამოღებულ რნმ-ს აქვს დნმ-ის დაბინძურება.
3. სტანდარტული მრუდი
ფერდობისა და გამოთვლის ფორმულის ჩათვლით, PCR ეფექტურობა შეიძლება გამოითვალოს ფორმულით.სრულყოფილი ექსპერიმენტისთვის საჭიროა, რომ სტანდარტული მრუდის დახრილობა 3.32-ს მიუახლოვდეს, ხოლო R² 0.9999-ს.
4. ხაზოვანი დინამიური დიაპაზონი
რეაქციის დინამიური დიაპაზონი წრფივია.სტანდარტული მრუდის გენერირებისთვის გამოყენებული შაბლონის მიხედვით, დინამიური დიაპაზონი უნდა შეიცავდეს მინიმუმ 5 კონცენტრაციის გრადიენტს და ყურადღება მიაქციოს Ct მნიშვნელობების ცვლილებას მაღალი კონცენტრაციის გრადიენტებში და დაბალი კონცენტრაციის გრადიენტებში.
5. გამოვლენის სიზუსტე
qPCR შედეგების ცვლილებები, ანუ ცუდი განმეორებადობა, ანუ ცუდი სიზუსტე, გამოწვეულია მრავალი ფაქტორით, მათ შორის ტემპერატურა, კონცენტრაცია და მუშაობა.qPCR სიზუსტე ზოგადად ხდება ნაკლებად კონტროლირებადი, როდესაც ასლების რაოდენობა მცირდება.იდეალურ შემთხვევაში, ექსპერიმენტული ვარიაციით, ეს ტექნიკური ვარიაცია უნდა განსხვავდებოდეს ბიოლოგიური ვარიაციისგან და ბიოლოგიურ რეპლიკატებს შეუძლიათ პირდაპირ მიმართონ სტატისტიკურ განსხვავებებს qPCR შედეგებში ჯგუფებსა თუ მკურნალობას შორის.კერძოდ, სადიაგნოსტიკო გამოკვლევებისთვის, უნდა იყოს მოხსენებული ანალიზების საუკეთესო სიზუსტე (განმეორებადობა) ობიექტებსა და ოპერატორებს შორის.
6. გამოვლენის ეფექტურობა და LOD (მულტიპლექს qPCR-ში)
LOD არის ყველაზე დაბალი კონცენტრაცია გამოვლენილი დადებითი ნიმუშების 95%.სხვა სიტყვებით რომ ვთქვათ, LOD-ის კონცენტრაცია, რომელიც შეიცავს სამიზნე გენის რეპლიკაციებს, არ უნდა აღემატებოდეს წარუმატებელი რეაქციების 5%-ს.მულტიპლექსი qPCR ანალიზის გაკეთებისას, განსაკუთრებით წერტილოვანი მუტაციების ან პოლიმორფიზმის ერთდროული გამოვლენისთვის, მულტიპლექს qPCR-მ უნდა უზრუნველყოს მტკიცებულება, რომ მრავალი სამიზნე ფრაგმენტის სიზუსტე არ არის კომპრომეტირებული ერთსა და იმავე მილში, მრავალჯერადი აღმოჩენა და ერთი მილის გამოვლენა ეფექტურობა და LOD უნდა იყოს იგივე.განსაკუთრებით მაშინ, როდესაც მაღალი კონცენტრაციის სამიზნე გენები და დაბალი კონცენტრაციის სამიზნე გენები ერთდროულად ძლიერდება, ამ პრობლემას ყურადღება უნდა მიექცეს.
პრობლემები და გადაწყვეტილებებიზოგადად, პრობლემები, რომლებიც ხშირად გვხვდება qPCR გამართვისას, ფოკუსირებულია შემდეგ ასპექტებზე:
· არასპეციფიკური გაძლიერება
·პრაიმერის კონცენტრაციის რთული არჩევანი და პრაიმერის დიმერების პრობლემა
· დამუშავების ტემპერატურა არაზუსტია
·მეორადი სტრუქტურა გავლენას ახდენს გაძლიერების ეფექტურობაზე
არასპეციფიკური გაძლიერება
არასპეციფიკური გაძლიერებახდება, ზოგადად განიხილება, არ არის თუ არა პრაიმერის დიზაინი შესაფერისი, მაგრამ თუ არ ჩქარობთ პრაიმერების შეცვლას, შეგიძლიათ ჯერ სცადოთ შემდეგი მეთოდები (პრინციპი ასევე თან ერთვის):
· გაზარდეთ დამუშავების ტემპერატურა - შეეცადეთ შექმნათ სუსტი წყალბადის ბმები, რომელთა შენარჩუნება შეუძლებელია;
· შეამოკლეს ანეილისა და დრეკადობის დრო - ამცირებს სუსტი წყალბადის ბმების შანსს;
·პრაიმერის კონცენტრაციის შემცირება - ჭარბი პრაიმერებისა და არასამიზნე რეგიონების შებოჭვის შანსების შემცირება;
დაბალი გამაძლიერებელი ეფექტურობა
არასპეციფიკური გაძლიერების საპირისპირო ვითარება - დაბალი გამაძლიერებელი ეფექტურობა და ზომები დაბალ გაძლიერების ეფექტურობის წინააღმდეგ არის ზუსტად საპირისპირო:
· გაახანგრძლივოს ადუღება და დრეკადობის დრო;
·შეცვალეთ სამსაფეხურიან PCR-ზე და შეამცირეთ ანეილირების ტემპერატურა;
·პრაიმერის კონცენტრაციის გაზრდა;
Ps90-იან წლებში დაბადებულ ბევრ კურსდამთავრებულს არ სურს შეისწავლოს ექსპერიმენტების გამართვა და იმედოვნებს, რომ ნაკრები პრობლემას მთლიანად გადაჭრის (თუ გსურთ რეაგენტების კომპანიაში წასვლა კვლევისა და განვითარების შემდეგ), ფაქტობრივად, რეაგენტის მწარმოებლებიც ასე ფიქრობენ, იმედი მაქვს, რომ ეს სისულელეა. სუსტი H- ბმის შთანთქმის ფაქტორები.პრობლემის მარტივად გადასაჭრელად სულელებს ჯერ კიდევ უწევთ რეაგენტების კომპანიის შესავალი წაკითხვა, რათა დაინახონ, არის თუ არა ფაქტორი, რომელიც შთანთქავს სუსტ წყალბადურ ბმებს.
პრაიმერის კონცენტრაციის რთული არჩევანი და პრაიმერ-დიმერების პრობლემა
მეთოდი 1: ზოგადად, qPCR-ის ნაკრების ინსტრუქციებს აქვს რეკომენდებული სისტემები და რეკომენდებული პრაიმერის კონცენტრაციები.
მეთოდი 2: გამართვა პრაიმერის კონცენტრაციის გრადიენტის დაყენებით.ქვემოთ მოყვანილი სურათი მოპარულია კომპანიისგან საილუსტრაციოდ.ქვემოთ მოყვანილი სურათი გვიჩვენებს ფლუორესცენციის რაოდენობრივ შედეგებს, რომლებიც შესრულებულია სამი პრაიმერის კონცენტრაციის გრადიენტით (100nM, 250nM, 500nM) და შაბლონის ოთხი კონცენტრაციის გრადიენტით (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng).ექსპერიმენტული შედეგების Ct მნიშვნელობა გამოსახულია შემდეგნაირად:

პრაიმერის კონცენტრაციის შერჩევა შეაერთეთ თითოეული პრაიმერის კონცენტრაცია ხაზში შემდეგნაირად:

პრაიმერის კონცენტრაციის არჩევანი აშკარაა, 100nM და 250nM პრაიმერის კონცენტრაციის წრფივი კავშირი უკეთესია, ხოლო 500nM პრაიმერის კონცენტრაციის ხაზოვანი ურთიერთობა შედარებით ცუდია.100nM და 250nM-ში Ct-ის მნიშვნელობა 250nM შედარებით მცირეა, ამიტომ პრაიმერის ოპტიმალური კონცენტრაციაა 250nM.ზოგადად მძიმე პრაიმერ-დიმერები ჩანს დნობის მრუდში.რა მოხდება, თუ დაპროექტებული პრაიმერები ვერ აიცილებენ პრაიმერ-დიმერებს?
მეთოდი 3: შეამცირეთ პრაიმერების რაოდენობა და გაზარდეთ დუღილის ტემპერატურა (ახსნა საჭირო არ არის).
ანეილირების ტემპერატურის ემპირიული მნიშვნელობა არის 60°C.თუ არ ხართ დარწმუნებული, როგორ ავირჩიოთ უფრო შესაფერისი ანეილის ტემპერატურა?პასუხი იგივეა, რაც პრაიმერის კონცენტრაციის არჩევანი -გრადიენტური ტესტი.გადაიღეთ სურათი Bio-rad კომპანიისგან პრობლემის საილუსტრაციოდ.გარკვეული სამიზნე ფრაგმენტის გასაძლიერებლად დააყენეთ რვა ტემპერატურული გრადიენტი, თითოეული სამი გამეორებით და მიღებული გამაძლიერებელი მრუდი არის შემდეგი:

დუღილის ტემპერატურის შერჩევა:
·70°C, 69°C-ძირითადად, პრაიმერების გაერთიანება შეუძლებელია, ამიტომ არ ხდება გაძლიერება.
·67.3°C – დასაწყისში არის მცირე რაოდენობის გაძლიერება და Ct-ის მნიშვნელობა შედარებით დიდია.
·64.5°C——Ct მნიშვნელობა მცირდება.
· 60.7°C, 58.0°C, 56.2°C და 55.0°C ტემპერატურაზე Ct მნიშვნელობები ძირითადად სტაბილური იყო, მაგრამ ფლუორესცენციის საბოლოო მნიშვნელობები განსხვავებული იყო.
როგორ ავირჩიოთ?პრინციპი: პირველი პრინციპი არის უმაღლესი Ct მნიშვნელობა.იგივე Ct მნიშვნელობისთვის, აირჩიეთ უფრო მაღალი ანეილირების ტემპერატურა, რათა თავიდან აიცილოთ დიმერიზაცია და არასპეციფიკური გაძლიერება.მიუხედავად იმისა, რომ 55°C ტემპერატურაზე უფრო მაღალია ფლუორესცენციის მნიშვნელობა, მასში შეიძლება იყოს დიმერები ან არასპეციფიკური გაძლიერება.
მაგრამ თუ შენსავით ჭკვიანი ხარ, აუცილებლად იფიქრებ: ლოგიკურად რომ ვთქვათ, თუ PCR რეაქცია ძალიან სპეციფიკურია, სანამ პრაიმერის კონცენტრაცია აჭარბებს მინიმალურ მოთხოვნას, მაღალ და დაბალ წერტილებს არანაირი ეფექტი არ უნდა ჰქონდეს, ისევე როგორც ფლუორესცენტური საღებავები და dNTP.მართლაც, სანამ დამუშავების ტემპერატურა სათანადოდ არის ოპტიმიზირებული, პრაიმერის კონცენტრაციის ეფექტი Ct-ის მნიშვნელობაზე ბუნებრივია მინიმუმამდე დაიყვანება.

ანეილირების ტემპერატურა სათანადოდ არის ოპტიმიზირებული და პრაიმერის კონცენტრაციის ეფექტი CT-ზე მინიმუმამდე იქნება შემცირებული
მეორადი სტრუქტურა გავლენას ახდენს გაძლიერების ეფექტურობაზე
ავიღოთ სურათი Bio-rad-დან პრობლემის საილუსტრაციოდ.ის ასევე შეიმუშავებს ტემპერატურულ გრადიენტს მეორადი სტრუქტურის მქონე გენის გასაძლიერებლად.

ჩნდება მეორადი სტრუქტურა
ჩანს, რომ ტემპერატურული გრადიენტის კლებასთან ერთად იწყება პროდუქტების გამოჩენა და Ct-ის მნიშვნელობა წინ მიიწევს, აღწევს მინიმალურ მნიშვნელობას 60.7°C-ზე, შემდეგ კი ტემპერატურის გრადიენტის კლებასთან ერთად Ct-ის მნიშვნელობა უფრო დიდი ხდება.პირიქით, ტემპერატურის მატებასთან ერთად, მეორადი სტრუქტურა იხსნება და იზრდება გამაძლიერებელი ეფექტურობა.გარკვეული ტემპერატურის მიღწევის შემდეგ, ტემპერატურის გაზრდა ვერ აუმჯობესებს გამაძლიერებელ ეფექტურობას.რადგან ამ დროს პრაიმერების სტაბილურად შერწყმა შეუძლებელია.ამიტომ,მოძებნეთ ტემპერატურა ყველაზე დაბალი Ct მნიშვნელობით, რომელიც საუკეთესო ტემპერატურაა მეორადი სტრუქტურის შაბლონის გასაძლიერებლად!რა თქმა უნდა, ჭკვიანმა სულელებმა უნდა იცოდნენ, რომ თუ ეს არ არის საჭირო, უმჯობესია შეცვალონ პრაიმერები და თავიდან აიცილონ მეორადი სტრუქტურის რეგიონი.
5. განაცხადის დონე
MIQE - მონაცემთა ანალიზი

მონაცემთა ანალიზი ძირითადად მოცემულია ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR ინსტრუმენტით.წინა სტატიაში გაკეთდა უამრავი მონაცემთა ანალიზის სამუშაო, როგორიცაა ცარიელი კონტროლი, რომელიც ახსნილია ექსპერიმენტის დიზაინში.დაზუსტებულია შიდა საცნობარო გენები, განმეორებითი რიცხვები და ა.შ.აქ ძირითადად განვმარტავთ qPCR-ის გამოყენებას.
qPCR ფართოდ გამოიყენება და ექსპერიმენტული ვერიფიკაცია და ნუკლეინის მჟავას დიაგნოზი ყველაზე ხშირად გამოყენებული სცენარია.
აბსოლუტური რაოდენობრივი განსაზღვრა
ლოგს (საწყის კონცენტრაციას) აქვს წრფივი კავშირი ციკლების რაოდენობასთან.სტანდარტული მრუდი შეიძლება შედგენილი იყოს სტანდარტიდან ცნობილი საწყისი ასლის ნომრით, ანუ შეიძლება მივიღოთ გამაძლიერებელი რეაქციის წრფივი ურთიერთობა.ნიმუშის Ct მნიშვნელობის მიხედვით, ნიმუშის კონცენტრაცია შეიძლება გამოითვალოს.ჩართული შაბლონების რაოდენობა.

აბსოლუტური რაოდენობრივი გაანგარიშების მეთოდი
აბსოლუტური რაოდენობები უნდა ეფუძნებოდეს სტანდარტულ მრუდს.სტანდარტული მრუდის შესაქმნელად საჭიროა სტანდარტი.ჩვეულებრივ, სტანდარტი არის პლაზმიდი, რომელიც მიიღება სამიზნე გენის კლონირებით.რატომ არის ეს პლაზმიდი?რადგან წრიული პლაზმიდური დნმ ყველაზე სტაბილურია.განზავდეს სტანდარტული პროდუქტი 5-დან 6 გრადიენტში გაორმაგების კოეფიციენტის მიხედვით (10-ჯერადი განზავება) და ყურადღება მიაქციეთ ერთგვაროვნებას განზავებისას.მოდით, Ct-ის მნიშვნელობა დაეცეს 15-30-ს შორის.

სტანდარტული მომზადება
ამავდროულად, შესამოწმებელი ნიმუში ასევე უნდა განზავდეს შესაბამისად (გახსოვდეთ განზავების ფაქტორი) და Ct მნიშვნელობა ასევე უნდა იყოს 15-30 შორის.სტანდარტული პროდუქტი + შესამოწმებელი ნიმუში მოთავსებულია მანქანაზე ერთად.გაშვების შემდეგ, სტანდარტული ნივთიერებით გაკეთდა სტანდარტული მრუდი და შესამოწმებელი ნიმუშები გადაიყვანეს სტანდარტულ მრუდში კონცენტრაციის გამოსათვლელად.
B ჰეპატიტის ვირუსის HBV რაოდენობრივი განსაზღვრა არის ტიპიური აბსოლუტური რაოდენობრივი მაჩვენებელი, რომელსაც შეუძლია გამოთვალოს ვირუსის ასლის რაოდენობა 1 მლ სისხლში.
ასლის ნომრის გაანგარიშება
ნიმუშის კონცენტრაცია შესამოწმებელი (ნგ/ულ) = OD260 × 50 მგ/მლ × განზავების ფაქტორი
ნიმუშის მოლეკულური წონა = ფუძეების რაოდენობა × 324
შესამოწმებელი ნიმუშის ასლის ნომერი (ასლები/ულ) = შესამოწმებელი ნიმუშის კონცენტრაცია / ნიმუშის მოლეკულური წონა × 6 × 1014

ასლის ნომრის გაანგარიშების მეთოდი

ზემოაღნიშნული არის რაოდენობის განსაზღვრის გაანგარიშების მეთოდი.ეს არის მათემატიკური პრობლემა, რომელიც შეიძლება გადაიჭრას უმცროსი სკოლის დამთავრების შემდეგ და მათემატიკური ამოცანები ზოგადად წყდება კომპიუტერებით.თუ არ გესმით, შეგიძლიათ მოხვიდეთ კომუნიკაციისთვის.
ფარდობითი რაოდენობები
ფარდობითი რაოდენობები ძირითადად გამოიყენება სამეცნიერო კვლევებში.რამდენი ვირუსია 1 მლ სისხლში და ეს არის დნმ-ის ვირუსი, ეს შედარებით განმსაზღვრელი მოვლენაა: სისხლის ოდენობის დადგენა შესაძლებელია და დნმ ვირუსი შედარებით სტაბილურია.თუმცა, ჩვენთვის რთულია ფოთოლში გარკვეული გენის ტრანსკრიფციული ასლების რაოდენობის შედარება, რადგან ძნელია ფოთლის ზომის, წონისა და სინაზის დადგენა, ამოღებული რნმ-ის ოდენობის დადგენა და საპირისპირო ტრანსკრიფციის ეფექტურობის დადგენა რთულია, ანუ რაიმე ნაბიჯი შეიძლება შეუძლებელი იყოს ექსპერიმენტული მონაცემების გამოყენებისას.
ამიტომ, ფარდობითი რაოდენობრივი განსაზღვრა უნდა შეიცავდეს ელემენტს:შიდა საცნობარო გენი.
სხვა სიტყვებით რომ ვთქვათ, ფარდობითი რაოდენობები რეალურად არის შედარება სამიზნე გენსა და შიდა საცნობარო გენს შორის.ერთსა და იმავე ქსოვილსა და ერთსა და იმავე უჯრედში შედარებით, ნიმუშის ზომაზე, რნმ-ის ექსტრაქციის რაოდენობაზე, საპირისპირო ტრანსკრიფციის ეფექტურობაზე და PCR-ის ეფექტურობაზე გავლენა შედარებით მცირეა.ნიმუშის მცირე ზომის გამო, როგორც შიდა საცნობარო გენები, ასევე სამიზნე გენები შედარებით შემცირდა.ამიტომაც ჩვენ აქამდე ხაზს ვუსვამდით ერთიანობასა და სტაბილურობას.
შიდა საცნობარო გენები ზოგადადსაყოფაცხოვრებო გენები(სახლის შემნახველი გენები), რომლებიც ეხება გენების კლასს, რომლებიც სტაბილურად არის გამოხატული ყველა უჯრედში და მათი პროდუქტები აუცილებელია უჯრედების ძირითადი სასიცოცხლო აქტივობის შესანარჩუნებლად.
არ აურიოთ ეს კონცეფცია.საყოფაცხოვრებო გენები ბიოლოგიური ფუნქციის ტერმინებია, ხოლო შიდა საცნობარო გენები ექსპერიმენტული ტექნიკური ტერმინებია.საყოფაცხოვრებო გენებმა უნდა გაიარონ ვალიდაცია, სანამ ისინი შეირჩევა შიდა საცნობარო გენებად.
მაგალითად, ჩვენ შევარჩიეთ რამდენიმე საყოფაცხოვრებო გენი ქვემოთ მოცემულ ფიგურაში მათი ექსპრესიის დონის შესამოწმებლად ქსოვილის სხვადასხვა უჯრედებში და აღმოვაჩინეთ, რომ β-2-მიკროგლობულინის ექსპრესიის დონეები საკმაოდ განსხვავდებოდა დანარჩენი სამი გენისგან, ამიტომ ისინი არ შეიძლება გამოყენებულ იქნას როგორც შიდა საცნობარო გენები.

შიდა საცნობარო გენის კორექტირების ფუნქციის გააზრების შემდეგ, ორი ალგორითმი მიიღება შიდა საცნობარო გენის დანერგვის გამო.
· ორმაგი სტანდარტული მრუდის მეთოდი
·2 – △△Ct მეთოდი (CT მნიშვნელობების შედარების მეთოდი)
თუ გაინტერესებთ სახეობებისა და გენების ფუნქციების შესწავლა, გთხოვთ, უარი თქვათ ალგორითმებზე კვლევაზე და პირდაპირ გამოიყენოთ ფორმულები, ან უშუალოდ გამოიყენოთ მანქანები;თუ მათემატიკასა და ინჟინერიაში პირდაპირი ბიჭი ხართ, გთხოვთ თავისუფლად იგრძნოთ თავი.
ორმაგი სტანდარტის მრუდის მეთოდი
საკონტროლო ნიმუშისა და შესამოწმებელი ნიმუშის რაოდენობრივად განსაზღვრეთ სამიზნე გენი და საყოფაცხოვრებო გენი სტანდარტული მრუდის მეშვეობით და შემდეგ გამოთვალეთ ფარდობითი მნიშვნელობა გაანგარიშების ფორმულის მიხედვით, რაც არის გამოხატვის ფარდობითი დონე.
უპირატესობები: მარტივი ანალიზი, შედარებით მარტივი ექსპერიმენტული ოპტიმიზაცია
მინუსი: თითოეული გენისთვის, ექსპერიმენტების ყოველი რაუნდი უნდა შეადგინოს სტანდარტული მრუდი
გამოყენება: ორი ყველაზე ხშირად გამოყენებული და აღიარებული შედარებით რაოდენობრივი მეთოდიდან ერთ-ერთი გენის ექსპრესიის რეგულაციის შესწავლაში
ფორმულა ასეთია:

მაგალითები შემდეგია:

გამოთვალეთ ფარდობითი თანხა რაოდენობრივი შედეგის მიხედვით
2 – △△Ct მეთოდი (CT მნიშვნელობების შედარების მეთოდი)

უპირატესობები: არ არის საჭირო სტანდარტული მრუდის გაკეთება
ნაკლოვანებები: ვარაუდობენ, რომ გამაძლიერებელი ეფექტურობა უახლოვდება 100%-ს;სტანდარტული გადახრა არის < 5%, ხოლო სტანდარტული მრუდი და ეფექტურობა თითოეულ გაძლიერებას შორის მიჩნეულია თანმიმდევრულად;ექსპერიმენტული პირობების ოპტიმიზაცია უფრო რთულია.
გამოყენება: ორი ყველაზე ხშირად გამოყენებული და აღიარებული შედარებით რაოდენობრივი მეთოდიდან ერთ-ერთი გენის ექსპრესიის რეგულაციის შესწავლაში

რა თქმა უნდა, ამპლიფიკაციის ეფექტურობა, როგორც წესი, შეუძლებელია იყოს სრულყოფილად 1. კორექტირების მეთოდი: თუ ვიცით, რომ სამიზნე გენსა და საცნობარო გენს აქვთ ერთი და იგივე გამაძლიერებელი ეფექტურობა, მაგრამ გაძლიერების ეფექტურობა არ არის 1-ის ტოლი, მაშინ 2-△△Ct შეიძლება გამოსწორდეს, როგორც: , მაშინ გამოთვლის ფორმულა შეიძლება გამოსწორდეს 1,95-△△Ct-მდე
ჯერჯერობით, შინაარსი ფლუორესცენტური რაოდენობრივი PCR-ის შესახებ დასრულდა.