(96 ჭაბურღილის) QuickEasy Cell Direct RT-qPCR ნაკრები – SYBR Green I
აღწერილობები
The(96 კარგად) QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR ნაკრები-SYBR მწვანე Iუზრუნველყოფსუნიკალური ლიზის ბუფერული სისტემაto სწრაფად ათავისუფლებს რნმ-სკულტივირებული უჯრედიდანნიმუშები RT-qPCR რეაქციებისთვის, რაც გამორიცხავს შრომატევადი და შრომატევადირნმ-ის გაწმენდის პროცესი და საჭირო რნმ შაბლონის მისაღებად მხოლოდ 7 წუთი სჭირდება.The5× პირდაპირი RT მიქსიდა2× Direct qPCR Mix-SYBRყუთში მოწოდებული შეიძლება სწრაფად დაეფექტურად მიიღოთ რაოდენობრივი რეალურ დროშიPCR შედეგები.
5× Direct RT Mix და 2× Direct qPCR Mix-SYBR აქვთ ძლიერი ინჰიბიტორების ტოლერანტობა და შეუძლიათ გამოიყენონ ნიმუშის ლიზატი შესამოწმებლად, როგორც შაბლონი ეფექტური საპირისპირო ტრანსკრიფციისთვის და სპეციფიკური გაძლიერებისთვის.რეაგენტი შეიცავს Foregene-ის უნიკალურ საპირისპირო ტრანსკრიპტაზას მაღალი აფინურობით რნმ-თან, ასევე ცხელ D-Taq დნმ პოლიმერაზას, dNTPs, MgCl.2 , რეაქციის ბუფერი, PCR ოპტიმიზატორი და სტაბილიზატორი და შეიძლება გამოყენებულ იქნას ლიზის ბუფერთან ერთად ნიმუშის სწრაფად, მარტივად და ზუსტად გამოსავლენად და აქვს მაღალი მგრძნობელობის, ძლიერი სპეციფიკისა და კარგი სტაბილურობის მახასიათებლები.
ნაკრები მიზნად ისახავს 96 კარგად კულტივირებული უჯრედების მიკროსისტემის ლიზისს და აქვს კარგი ერთგვაროვნება და თანმიმდევრულობა;ნაკრების კომპონენტები უზრუნველყოფენ 96 ლიზის რეაქციას, 96 საპირისპირო ტრანსკრიფციის რეაქციას და 96×2 qPCR რეაქციას, რომლებიც აკმაყოფილებენ 96 ჭაბურღილის უჯრედის ფირფიტას ერთჯერადი გამოყენებისთვის, თავიდან აიცილონ დაბინძურება, რომელიც გამოწვეულია რეაგენტების განმეორებითი გახსნით, გაყინვით და დათბობით და რეაგენტის მუშაობის დაქვეითებით.
ნაკრების კომპონენტები
| ნაკრების შემადგენლობა ( 50 μL ლიზის სისტემა/20 მლRT რეაქციის სისტემა /20μL qPCR რეაქციის სისტემა) | DRT-03011 | შენიშვნა | |
| 96ტ | |||
| ნაწილიI | ბუფერიCL | 5 მლ | უჯრედილიზისი |
| ფორეგენიპროტეაზა პლუს II | 100 μL | ||
| ბუფერიST | 500 μL | ||
| ნაწილი II | დნმსაშლელი | 100 μL | |
| 5× პირდაპირი RT მიქსი | 400 μL | RT | |
| 2× Direct qPCR Mix-SYBR | 1 მL × 2 | qPCR | |
| 50× ROX Reference საღებავი | 400μL | ||
| RNase- უფასოddH2 O | 1.7 მლ |
| |
| Mწლიური | 1 ნაჭერი | 1 პორცია | |
*: ლიზისის რეაგენტი დნმ საშლელი შედის ნაკრების II ნაწილში;Cell Lysis, RT და qPCR კომპონენტების შეძენა შესაძლებელია ცალკე.
მახასიათებლები და უპირატესობები
■მარტივი და ეფექტური: Cell Direct RT ტექნოლოგიით, რნმ-ის ნიმუშების მიღება შესაძლებელია მხოლოდ 7 წუთში.
■ ნიმუშის მოთხოვნა მცირეა, შესაძლებელია 10 უჯრედის ტესტირება.
■ მაღალი გამტარუნარიანობა: მას შეუძლია სწრაფად აღმოაჩინოს რნმ უჯრედებში, რომლებიც კულტივირებულია 384, 96, 24, 12, 6 ჭაბურღილის ფირფიტებში.
■ დნმ-ის საშლელს შეუძლია სწრაფად ამოიღოს გამოთავისუფლებული გენომები, მნიშვნელოვნად შეამციროს გავლენა შემდგომ ექსპერიმენტულ შედეგებზე.
■ ოპტიმიზებული RT და qPCR სისტემა ხდის ორეტაპიან RT-PCR საპირისპირო ტრანსკრიფციას უფრო ეფექტურს და PCR-ს უფრო სპეციფიკურს და უფრო გამძლეს RT-qPCR რეაქციის ინჰიბიტორების მიმართ.
ნაკრების აპლიკაცია
გამოყენების სფერო: კულტივირებული უჯრედები.
- ნიმუშის ლიზისით გამოთავისუფლებული რნმ: გამოიყენება მხოლოდ ამ ნაკრების RT-qPCR შაბლონზე.
- ნაკრების გამოყენება შესაძლებელია შემდეგი მიზნებისთვის: გენის ექსპრესიის ანალიზი, siRNA-ს შუამავლობით გენის გამაჩუმებელი ეფექტის შემოწმება, წამლების სკრინინგი და ა.შ.
შენახვა და შენახვის ვადა
ამ ნაკრების I ნაწილი უნდა ინახებოდეს 4-ზე℃;II ნაწილი უნდა ინახებოდეს -20℃ ტემპერატურაზე.
Foregene Protease Plus II უნდა ინახებოდეს 4-ზე℃, არ გაყინოთ -20℃.
რეაგენტი 2×Direct qPCR Mix-Taqman უნდა ინახებოდეს -20-ზე℃სიბნელეში;თუ ხშირად გამოიყენება, ის ასევე შეიძლება შენახული იყოს 4-ზე℃ მოკლევადიანი შენახვისთვის (გამოიყენება 10 დღის განმავლობაში).
რეალურ დროში PCR პრაიმერის დიზაინის პრინციპები
Forward Primer და Reverse Primer
Real Time PCR-სთვის პრაიმერის დიზაინი ძალიან მნიშვნელოვანია.პრაიმერები დაკავშირებულია PCR გაძლიერების სპეციფიკასთან და ეფექტურობასთან და შეიძლება შეიქმნას შემდეგი პრინციპების მიხედვით:
- პრაიმერის სიგრძე: 18-30bp.
- GC შემცველობა: 40-60%.
- Tm მნიშვნელობა: პრაიმერის დიზაინის პროგრამულ უზრუნველყოფას, როგორიცაა Primer 5, შეუძლია პრაიმერის Tm მნიშვნელობა მისცეს.ზედა და ქვედა დინების პრაიმერების Tm მნიშვნელობები უნდა იყოს რაც შეიძლება ახლოს.ასევე შეიძლება გამოყენებულ იქნას Tm გამოთვლის ფორმულა: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).PCR-ის ჩატარებისას, პრაიმერის Tm მნიშვნელობის 5 °C-ზე დაბალი ტემპერატურა, როგორც წესი, შეირჩევა ანეილირების ტემპერატურად (შედუღების ტემპერატურის შესაბამისმა ზრდამ შეიძლება გაზარდოს PCR რეაქციის სპეციფიკა).
- პრაიმერი და PCR პროდუქტები:
- დიზაინის პრაიმერის PCR გამაძლიერებელი პროდუქტის სიგრძე სასურველია იყოს 100-150bp.
- შეძლებისდაგვარად თავიდან უნდა იქნას აცილებული დიზაინის პრაიმერები შაბლონის მეორად სტრუქტურულ ზონაში.
- მოერიდეთ 2 ან მეტი დამატებითი ფუძის წარმოქმნას ზედა და ქვედა დინების პრაიმერების 3' ბოლოებს შორის.
- პრაიმერის 3' ტერმინალის ბაზა არ შეიძლება იყოს 3 დამატებითი თანმიმდევრული G ან C.
- თავად პრაიმერებს არ შეიძლება ჰქონდეთ დამატებითი სტრუქტურები, წინააღმდეგ შემთხვევაში წარმოიქმნება თმის სამაგრი სტრუქტურა, რაც გავლენას მოახდენს PCR გაძლიერებაზე.
- ATCG უნდა განაწილდეს რაც შეიძლება თანაბრად პრაიმერის თანმიმდევრობით და 3' ტერმინალური ბაზა თავიდან უნდა იქნას აცილებული, როგორც T.
დანართი1: Cell პირდაპირიRT-qPCR ნაკრების კომპონენტიt დანამატის პაკეტი
1.უჯრედის ლიზისის ხსნარი
| უჯრედის ლიზისის ხსნარი | |||
| ნაკრების კომპონენტები (24 ჭაბურღილის ლიზის სისტემა / ჭა) | DRT-01011-A1 | DRT-01011-A2 | |
| 100 ტ | 500 ტ | ||
| ნაწილიმე | ბუფერი CL | 20 მლ | 100 მლ |
| Foregene Protease Plus II | 400 მლ | 1 მლ × 2 | |
| ბუფერი ST | 1 მლ × 2 | 10 მლ | |
| ნაწილიII | დნმ-ის საშლელი | 400 მლ | 1 მლ × 2 |
| RT მიქსი | |
| ნაკრების კომპონენტები (20 მლ რეაქციის სისტემა) | DRT-01011-B1 |
| 200 ტ | |
| 5× პირდაპირი RT მიქსი | 800 მლ |
| RNase-ის გარეშე ddH2O | 1.7 მლ × 2 |
| qPCR Mix | ||
| ნაკრების კომპონენტები (20 მლ რეაქციის სისტემა) | DRT-01021-C1 | DRT-01021-C2 |
| 200 ტ | 1000 ტ | |
| 2× პირდაპირი qPCR Mix-Taqman | 1 მლ × 2 | 1.7 მლ × 6 |
| 20× ROX Reference საღებავი | 40 მლ | 200 მლ |
| RNase-ის გარეშე ddH2O | 1,7 მლ | 10 მლ |
ინსტრუქციის სახელმძღვანელოები:
